簇毛麦抗白粉病染色体分子标记研发应用与NBS类R基因序列分离.docVIP

　　簇毛麦抗白粉病染色体分子标记研发应用与NBS类R基因序列分离 第一章 文献综述 1.1小麦及其近缘种 小麦隶属于禾本科小麦族小麦属，一年生或越年生草本。在我国主要分布于秦岭、淮河以北，长城以南，河南、河北、山东、陕西、山西、江苏、四川、安徽、湖北、黑龙江、新疆、甘肃和内蒙古诸省区，是我国最主要的粮食作物。随着世界人口的日益激增，在保持小麦现有种植面积和水平不变的情况下，为满足人们日益增长的需求，小麦年产量须至少以 2%的速率递增[1]。但是，随着全球变暖、水肥施用量的逐增以及栽培密度的加大等，小麦病害的发生和流行日趋加重[2]，在一定程度上增加了小麦产量递增的难度。从长远考虑，育种工必须充分挖掘和利用新的抗病基因，丰富普通小麦抗病基因资源，扩大小麦育种的遗传基础，培育具有多个抗病基因的小麦品种（系），从而拓宽小麦抗病品种的广谱性和持久性。小麦抗病性研究的基础是抗源的多样化，从小麦属及小麦族中寻找、挖掘抗性基因并用于改良小麦品种一直是抗病研究的重点，尤其是小麦近缘种中的抗性基因。小麦近缘种泛指小麦族中小麦属以外的植物，如簇毛麦、山羊草属中的不同种、大麦属、冰草属、黑麦属、偃麦草属及鹅冠草属等。小麦近缘种中蕴含着大量的有益基因，将近缘种中的优良基因导入小麦品种中，近年来在国内外都有较多报道，尤其是在抗病性育种方面[3]，并取得了显著成效，如目前正式命名的 59个抗小麦白粉病的主效基因中，有至少 33 个于小麦近缘种[4-10]；南京农业大学发现并鉴定的于簇毛麦的 Pm21 基因对现有的白粉菌生理小种均表现免疫，而且在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定[11,12]。目前已通过染色体工程将黑麦、簇毛麦、中间偃麦草、拟鹅冠草、山羊草等近缘种质的有益基因导入小麦。 .. 1.2小麦近缘种中有益基因的导入方法 普通小麦与其近缘植物的杂交一般都称为远缘杂交。小麦远缘杂交是探讨相关物种的基因组关系和物种间的系统演化的主要途径之一，也是导入外源有益基因、创制新的种质资源、丰富小麦遗传基础、对栽培品种进行遗传改良的重要手段之一，是人工合成新物种的重要方法之一。将外源有益基因转入普通小麦中，常会出现远缘杂交不亲和、花粉败育、杂种易夭亡、疯狂分离等现象，将种间或属间杂种 F1进行染色体加倍，合成双二倍体可克服上述遇到的主要障碍。因此，培育属间或种间双二倍体是外源有益基因转入普通小麦过程的关键步骤。目前，已在小麦与黑麦、中间偃麦草、长穗偃麦草、簇毛麦、百萨偃麦草、大麦等多个物种中合成了双二倍体。因为只有少数双二倍体，如八倍体小黑麦(AABBDDRR)可直接用于生产，所以育种家们通常采用桥梁亲本法、双重单体或多重单体附加法、单倍体法、双二倍体回交法等杂交手段用以培育小麦种质；将这些方法与电离辐射、组织培养、遗传控制体系和杀配子染色体等技术相结合以诱导染色体易位，达到外源染色体小片段易位的目的，从而保持小麦亲本的优良特性。随着转基因技术的兴起，基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、PEG 介导法以及通过物理、化学手段使花粉或细胞表面形成微通道便于外源基因进入（如：离子束介导法、微针注射法、超声波花粉介导法、电穿孔转化法等）等方法，在小麦种质改良方面的应用日益广泛。目前，在小麦遗传转化体系中应用最多、效果最好的是基因枪法，其次是农杆菌介导法，花粉管通道法也以其特有的优点也受到了育种工的重视，这些都使得小麦育种效率获得了前所未有的提高。 .. 第二章 簇毛麦染色体标记的开发 2.1 试验材料 2.1.1 植物材料 于英国剑桥植物园的簇毛麦 RM3159 由南京农业大学陈佩度教授提供；引自前苏联的簇毛麦 NO.1026 由原中国农业科学院作物品种资源研究所陶琨研究员提供；中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种课题组培育的硬-簇（NO.1026）双二倍体 TH1 及(TH1/CS.Ph)F150-3、TH1.G.Murray 等[135]的方法进行并略作修改。 2.1.3 植物材料总 RNA 提取及其反转录 在簇毛麦 RM3159 和 NO.1026、小麦宛 7107 植株长至 3 叶期时接种白粉菌，取接菌后 0h、6h 样品，按照 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]说明书提取各材料的总 RNA，按照东洋纺反转录酶[东洋纺（上海）生物科技有限公司]的使用说明合成 cDNA 第一链，-80℃保存备用。 . 2.2 结果与分析 利用 DNAMAN 软件对序列 Stpk-v/Stpk-v2/Stpk-v3/Stpk-a/Stpk-b/Stpk-d的启动子区序列进行限制性内切酶位点分析，选用在上述所有序列中不存在酶切位点的 BglII 酶，进行基因组 DNA酶切，图 1 显示部分基因组 DNA 酶切效果图：簇毛麦，小麦近缘种，含诸多