FFPE样品DNA提取SOP.docxVIP

FFPE样品DNA提取SOP一、目的使用QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit提取FFPE样品中的DNA并纯化，得到合格的DNA片段，为后续实验做准备。二、背景介绍从FFPE样品中直接提取DNA是很困难的，在进行福尔马林固定时，生物分子彼此进行交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。同时FFPE样品的珍贵性导致没有大量的材料可用于分析物纯化和下游分析，因此纯化步骤必须是高效的。三、技术特点QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Kit提供了一个克服交联的有效方法，并不需要过夜培养。此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。样品先用蛋白酶K在56°C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。接着是优化缓冲液中的90°C孵育，这可使部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂。四、试剂储存1. QIAamp吸附柱应储存在2–8°C，短时间（一个星期内）使用的可以储存在室温中2.缓冲液储存在室温中（15–25°C）3.蛋白酶K可储存在室温中，若时间较长或室温超过25℃就需储存在2–8°C中五、自备试剂和仪器耗材二甲苯乙醇（96-100%）1.5ml和2.0ml离心管移液吸头（为避免交叉污染，最好使用带滤芯的的吸头）带孔泡沫浮漂双孔的水浴锅或加热轨道的孵化器涡漩震荡仪小型高速离心机Qubit荧光计六、安全细则1.二甲苯是有毒试剂，进行实验时带好防护用品，并在生物安全柜中进行操作。2.Buffer AL 和 Buffer AW1中含有盐酸胍，可以溶解蛋白质，导致细胞结构破坏。（如果包含这个缓冲液溢出的液体，用合适的实验室洗涤剂和水清洁。如果洒出的液体包含潜在的传染性病原体，清洁受灾地区先用实验室的洗涤剂和水，然后用1%(v / v)次氯酸钠）3.遗弃的废液和枪头要用专用的容器收集，集中处理4.固定操作区域，避免造成环境污染或样品串染七、操作指南1.试剂盒组成名称数量QIAamp吸附柱50个吸附柱收集管（2ml）3*50个Buffer ATL14mlBuffer AL12mlBuffer AW1 (浓缩)19mlBuffer AW2 (浓缩)13mlBuffer ATE20ml蛋白酶 K1.25ml2.实验流程3.实验试剂的准备3.1.检查QIAamp DNA FFPE Tissue Kit缓冲液检查Buffer ATL及Buffer AL原液是否有沉淀物形成。有沉淀形成时，须升温至70℃同时适度晃动，使沉淀物全部溶解。3.2.配置Buffer AW1在19ml Buffer AW1原液中加入25ml(96-100%)无水乙醇，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无水乙醇的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。3.3. 配置Buffer AW2 在13ml Buffer AW2原液中加入30ml(96-100%)无水乙醇，盖紧瓶盖并摇匀。在试剂瓶上作已加入无水乙醇的标记，同时须标注配置时间。配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。4.实验步骤1.先将水浴锅一侧开启，并预热到56℃，为后续裂解准备。2.从送检的FFPE样品中选取8张10μm厚和250mm2的石蜡组织切片，同时取相同数量的1.5ml离心管，并在管盖上做好对应的标记。3.将选取的石蜡组织切片置入已做好标记的1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯。盖紧盖子并使用涡漩振荡器充分振荡10s。4. 使用小型高速离心机在16000rpm离心2min。实验全程须保持在室温状态下进行(15~25°C)。5. 离心结束后，使用移液器吸取并遗弃上部已溶解石蜡的二甲苯溶液，操作中应注意不要吸取到下方的组织。6.加入1ml 96％~100%无水乙醇，再次涡漩振荡器充分振荡。目的是用乙醇充分溶解组织中残留的二甲苯。7.在室温下使用小型高速离心机在16000rpm离心2min。8.先使用大量程的移液器吸取并遗弃大部分已溶解二甲苯的酒精溶液（吸取时要缓慢），然后使用细小的移液器头并应注意不要吸取到下方荡洗后的组织。9.在室温下打开离心管盖子，静置10min至所有残余酒精全部挥发。10.加入180μl buffer ATL及20μl蛋白酶K，涡旋振荡器充分振荡。11.封口膜封闭已加入试剂的离心管，分别将其插入浮漂并置于预先已升温至56°C的水浴锅中。孵育一小时，至组织完全裂解完毕。12.预先加热另一侧水浴锅至90°C，1h后将56°C水浴锅中组织已完全裂解的样本取出置于90°C水浴锅中，孵育1h。注意应严格控制温度以及孵育时间，过高的温度以及过长的时间可能损害最终所提取DNA的完整。过短时间和较低温度则可能造成福尔马林解铰联不彻底，DNA提取总量降低。13.1h后将标本取出用纸吸掉管外部的水，然后瞬时离心，