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第二章 基因工程的载体和工具酶;引 言;Characteristics of vectors for gene cloning;一、 质粒载体 （plasimid vectors）;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（二）质粒DNA的制备;碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。;碱变性法提取质粒的步骤： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。 3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。;（三）质粒载体的改造;1、质粒pBR322;pBR322质粒的优点： （1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6×106Da， （2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。 （4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。 ;;奏姜肌看萎拎矫曝美胁掳倘序志寐白钨恨咽任菩铬雏妮疡喳精俄昨凰博糖更多的地方更多的地方;2、pUC质粒载体;2、pUC质粒载体;?-互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌?-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的?-片段和?-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶?-片段的LacZ’ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的?片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ’ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 ?-片段就能和寄主编码的?片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是 alpha-complementation. X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ;;二、 噬菌体载体 （phage vectors）;1. 噬菌体的生物学特性;1. 噬菌体的生物学特性;2. ?噬菌体的生物学特性;2. ?噬菌体的生物学特性;2. ?噬菌体的生物学特性;;① Insertion vectors;②Replacement vectors;（二）M13噬菌体;M13噬菌体的复制与增殖;2. M13噬菌体载体的构建;（三）柯斯质粒载体（cosmid vectors）;（三） 柯斯质粒载体（cosmid vectors）;（三） 柯斯质粒载体（cosmid vectors）;;第二节 基因操作的工具酶;（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类 （三）限制性核酸内切酶的命名 （四） II型限制性核酸内切酶的基本特性 （五）限制性核酸内切酶的消化反应;; E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。;限制—修饰的酶学系统;最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶—1970年，H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease