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封面故事 - 搞定 Western Blot 六大問題 搞定 Western Blot 撰文:謝馨慧 常見六大問題 西方墨點法 (Western Blot) 為常見的免疫學實驗技術之一，這項技術是由 美國史丹佛大學的 Towbin, et al. 於 1979 年提出此方法的雛形，主要是將 polyacrylamide gel 上的蛋白質轉漬到 nitrocellulose 轉漬膜上的方法以 及應用，然而在 1981 年時，Burnette 將這種利用抗體與抗原之間高度專 一性結合去偵測蛋白質的方法命名為 Western blotting，又稱做 immu- noblotting。其實驗原理相當簡單，先將跑完電泳的蛋白質轉漬到 PVDF 或是 Nitrocellulose 膜上，利用阻隔劑 (Blocking buffer) 降低非專一性的 結合，並再利用有興趣的抗體去做後續的偵測(圖1)。然而，在這樣普及 的技術中，因過程繁瑣加上需準備物品多，因此影響結果呈現的變因也相 當的多，遇到問題的解決方式也都不同，以下為大家整理一些Western Blot 常見的六大魔王，如果每個讀者都可以打敗這些問題，相信一定都做 出無可挑剔的 Data。 Coupled Enzyme 魔王一 Secondary Antibody 背景值太高，無法分辨目標蛋白 Primary Antibody Immobilized Protein 原因1: 抗體濃度過高 在購買抗體的時候，無論是一抗或是二抗，通常會特別 Protein Binding Membrane 注意實驗的抗體稀釋倍數去做選擇，然而這樣的稀釋倍 圖1、Western Blot 的基本原理 數真的可信嗎?每一次的實驗都會因為使用的呈色試劑 、轉漬膜甚至是樣品的不同導致會有不同的結果，因此 沒有一定的”最佳濃度”，建議在實驗前先測試抗體適 X 用的濃度，再去做後續的實驗，尤其是利用高靈敏度的 呈色劑，例如 G-Biosciences 的 femto LUCENT PLUS 冷光呈色劑，是市面上最靈敏的呈色劑，更要稀釋抗體 濃度，才不會有背景全黑的現象，也可為實驗室節省抗 體用量。然而一旦發生這樣的現象，也可以先簡單稀釋 抗體濃度即可有效降低雜亂的背景值，避免黑漆漆的尷 尬data，也可以節省抗體用量達到節省經費的效果喔! 圖2、左邊為正常的結果，右邊則背景過高，無法分辨訊號 圖3、增加抗體稀釋倍數可有效降低背景值。 4 岑祥股份有限公司 .tw 台北02-2785-1156 新竹03-530-7592 台中04-2471-0255 高雄07-343-1735 封面故事 - 搞定 Western Blot 六大問題 原因2: HRP聚集成團 此外，如果使用保存過久的二抗也會有斑點型的背景產生，主要原因是因為 HRP 會聚集在一起，因此在呈色 時會有訊號不平均或是斑點型