蓝氏贾第鞭毛虫PPDK特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建及鉴定.pdfVIP

第 15卷 第1期 寄生虫与医学昆虫学报 V01．15。No．1 2008年3月 Acta Parasito1．Med．Entomo1．Sin Mar．，2008 蓝氏贾第鞭毛虫PPDK特异性锤头状 核酶．GCV重组载体的构建及鉴定* 曹利静 冯宪敏 卢思奇 张西臣 王风云 (1．首都医科大学病原生物学系，北京 100069；2．吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062) 摘要 丙酮酸磷酸双激酶 (Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)可能是蓝氏贾第鞭毛虫能量代谢中具有催化 作用的关键酶桩一。为了进一步探讨该酶在贾第虫能量代谢中的作用，本文采用RNA draw软件分析贾第虫 编码 PPDK的基因序列并设计特异性反义锤头状核酶 (Hammerheade ribozyme)，克隆该核酶序列并与犬贾第 虫病毒 (GCV)连接，构建了载有特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体pGCV634／H5／2174。该载体经线 性化处理后进行体外转录，转录产物以电击方式转染对数生长期的贾第虫滋养体。提取转染后24 h虫体总 RNA，并以其为模板进行RT—PCR验证转染效果和对靶mRNA的切割效果。结果初步证实了该载体对虫体细 胞内编码PPDK的mRNA具有切割作用。 关键词 蓝氏贾第鞭毛虫；丙酮酸磷酸双激酶；锤头状核酶；贾第虫病毒 蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia或称 G． 1993)。因而，磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸， intestinalis，G．duodinalis，简称贾第虫)呈世界 即成为虫体糖酵解过程中获取能量的关键步骤。 性分布，是一种寄生于人和多种哺乳动物肠道内 在贾第虫的糖代谢过程中，存在着磷酸烯醇式丙 的微需氧寄生性原生生物 (Tekwani and Mehlotra， 酮酸向丙酮酸、草酰乙酸或丙酮酸向丙氨酸、乙 1999)。虫体侵入宿主后引起以腹泻和消化不良 醇或醋酸盐转变等多种代谢趋向。其中磷酸烯醇 为主的人兽共患贾第虫病 (Giardiasis)(Mariante 式丙酮酸和丙酮酸在这些代谢途径中的地位尤为 et a1．，2005)。自20世纪70年代以来，世界各 重要，它们最终的代谢转归取决于磷酸烯醇式丙 地屡有贾第虫病的流行甚至暴发流行的报道。本 酮酸向丙酮酸转变过程中某些酶类的催化活性 病已被列为危害全球人类健康的l0种主要寄生 (Park et a1．，1997)。研究表明，在同属于厌氧 虫病之一。 生物的溶组织阿米巴 (Entamoeba histolytica)原 贾第虫是 一种原 始 的源 真核 生物 虫体 内，这一过程是由丙酮酸磷酸双激酶 (Achezoa)，不具备线粒体 (Hndtrmrk，1980)，其 (Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)催化完成的 生命活动所需的能量主要通过无氧糖酵解获得 (Emma et a1．，1998；Marcela et a1．，2004)。近 (Meixia and Wang，2000)。贾第虫的代谢既有真 年来的报道也表明，在贾第虫体内同样存在编码 核生物的某些特征，又与细菌和原核生物等低等 丙酮酸磷酸双激酶的基因。Bruderer等 (1996) 生物有相似之处 (Lindmark，1980；Brown et a1．， 和Hihpold等 (1999)已分别成功地从贾第虫基 1998)。编码贾第虫能量代谢中某些酶 (如丙酮 因组中克隆出了编码PPDK的基因序列 (Bruderer 酸磷酸双激酶)的基因序列与某些植物、细菌和 et a1．，1996；Hihpold et a1．，1999)。目前对于 寄生性原虫相应酶的基因序列