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基因工程技术 (Genetic engineering);2. 基因工程（genetic engineering）：在分子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等;;G;三、基因工程实验特点及要求;第一次实验: 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析 第二次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接 第三次实验：重组质粒的转化、Southern杂交演示 第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备） 第五次实验：RT-PCR、考试;实验一 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析;鸭卑唯矽彼谜顽屹郝岩储班齐游驮菠贷吗吾能找笑枉岩弄涩醉宇幻驱坊赶(七年制与研究生)基因工程(七年制与研究生)基因工程;基本步骤：;碱变性抽提质粒DNA原理：;质粒DNA的纯化：;CsCl密度梯度超速离心法：;Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）;LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。 聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA;操作步骤:;加等体积酚 氯仿异戊醇;DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离;DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：;DNA浓度及纯度分析: 紫外分光光度法;结果分析：;第二次试验：构建重组DNA;一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解 ;BamHⅠ;命名方式（以Hind III为例）： 属： H—Haemaphilus 种： in—influenza 株： d—ｄ株 编号： Ⅲ ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;限制性内切酶（ＲＥ）单位及实际用量： 在限定的温度和反应环境中，１小时消化1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用3-5u/ugDNA，延长３小时以上??是酶切反应更彻底。 RE保存条件：50%甘油中，用时需稀释10倍以上才能解除抑制。;酶切系统组成及计算方法：根据DNA量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。;操作步骤：;三、DNA片段回收及纯化;三、DNA片段回收及纯化;纯化：;制胶 点样 电泳分离 回收片段 抽提沉淀DNA。 ;结果分析：;; marker;四、DNA片段的重组连接;2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器 3.影响重组连接因素:目的基因的浓度与载体的比例(3-5:1)；离子浓度；温度：14-160C。 4.DNA连接酶单位：用Weiss单位对酶进行标化：1个Weiss单位指在370C下20分钟内催化1nmol32Pi从焦磷酸根置换到[γ,β-32Pi]ATP所需的酶量。;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;连接体系;第三次实验 感受态细菌的制备及转化实验;2.感受态形成假说： 局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些小孔，允许外来DNA分子进入。 酶-受体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转入胞内。;3.制备方法： 电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易死亡，约一半以上的细胞死亡。 化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。;4.受体菌的改造与选择：;转化时期选择：;