噬菌体展示系统.PPT

3.目标抗体的筛选 ： 工程抗体的体外成熟对医疗领域具有重要的作用,通过噬菌体抗体库的筛选是抗体体外成熟的其中一种方式,通过不断地筛选,从而促使阳性克隆不断地富集。 最常见的筛选方法包括固相筛选、生物素筛选和液相筛选等。Burmester等构建了青霉素免疫单链抗体库,并利用免疫试管包被transferrin-EMCS-ampicillin进行抗体的筛选。Yuan等从7个不同的人种,共47个健康人类的血液中提取基因,构建了人源天然scFv噬菌体抗体库,并利用细胞筛选的方法获得anti-MISIIR单链抗体分子。 4.目标抗体的表达： 外源基因的克隆表达主要有两种途径,即原核表达及真核表达,原核表达主要是通过大肠杆菌进行表达,真核表达主要是通过酵母菌进行表达,如毕赤酵母菌;噬菌体展示抗体的表达多是通过各种不同的E. coil菌种进行表达,如HB2151、pMF3、pHOG-21。 5.噬菌体抗体库的应用： 噬菌体展示抗体的应用已逐渐深入抗体工程的多个领域如医疗制药、基于ELISA技术的食品和环境的安全检测及蛋白质相互作用等。 ①在医疗制药方面的研究应用 ： 对老年痴呆症、狂犬病 、抗肿瘤药物载体 、SARS 、HIV、肝炎、结核病等疾病方面都有很大的帮助。 ②在食品环境检测中的研究应用 ： Zhao等利用噬菌体抗体库成功筛选得到了低分子量环境毒素-微囊藻毒素的目标抗体,为环境中小分子毒素的研究提供了新的途径。 Li等以pCANTAB5E为噬菌体载体,构建了甲胺磷的小鼠免疫抗体库,利用ELISA的方法筛得了三个阳性克隆并进行了可溶性表达。 Brichta等利用天然噬菌体抗体库对2, 4-D除草剂进行了筛选研究。 ③在蛋白质与蛋白质相互作用方面的研究应用：　 Smith等利用噬菌体抗体库技术获得4-乙酰氨基苯酚的亲和肽,对低分子量蛋白质之间的相互作用进行了相应的研究,为传感器的研究提供了实验依据。 孔波等利用pHEN1-KM13噬菌体展示系统表达了融合的谷胱甘肽S转移酶,并通过已知的小分子蛋白与该重组大蛋白进行相互作用,证明了表达的该大分子量重组蛋白具有生物活性。 三、噬菌体效价的测定 效价(滴度Title)-------是微生物或其产物、抗原与抗体等活性 高低的标志。 噬菌体效价--------指噬菌体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每毫升中含有的噬菌斑形成单位（plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效价。 一步生长（One-step growth) 测定噬菌体生长的方法 高浓度敏感细菌 ＋ 适量噬菌体 相混合一定时间 (5min) 除去游离噬菌体 进行高倍稀释 培养 定时取样测定噬菌体数 潜伏期（latent phase)＝eclipse phase + intracellular accumulation phase)—从噬菌体吸附菌细胞至菌细胞释出新噬菌体的最短时间。 裂解 期（rise phasse)—宿主裂解，噬菌体数不断增加的时期。 平稳期(plateau phase)—宿主全部裂解，噬菌体达最高点后的时期。 裂解量(Burst phase)—每个被感染细菌释放新的噬菌体的平均数。 温和噬菌体的生存周期 第二章 噬菌体的相关技术 一、噬菌体的侵染过程： 1.吸附 2.侵入 3.增殖 4.成熟（装配） 5. 释放 1.吸附：当噬菌体与其相应的特异宿主在水环境中发生偶然碰撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体（蛋白质、多糖或者脂蛋白-多糖复合物等）接触后，就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，随即就附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细胞表面。 吸附作用受许多外来因素的影响，如噬菌体的数量，阳离子浓度，温度和辅助因子（色氨酸、生物素等） 2.侵入：吸附后尾丝收缩，基板从尾丝中获得一个构象刺激，促使尾鞘中的144个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩成原长的一半，由此把尾管推出并插入细胞壁和膜中。此时尾管端所携带的少量溶菌酶可把细胞壁上的肽聚糖水解，以利侵入。头部的核酸迅速即通过尾管及其末端小孔注入宿主细胞中，并将蛋白质躯壳留在壁外。从吸附到侵入的时间极