糖多孢红霉菌TetR家族转录调控子SACE_3446调控红霉素生物合成的探究.pdfVIP

摘要 摘要 (Saccharopolysporaerythraea，亦称为红色糖多孢菌)的次级代谢产物，为一类临 床上应用较为广泛的大环(十四元环)内酯类抗生素。红霉素及其化学衍生物(克拉 霉素、阿奇霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素等)每年的销量达数十亿美元。 由于红霉素在医药领域的重要作用，因此在工业生产中寻找高产菌株显得尤为重 要。传统的高产菌株主要依靠随机诱变获得，这种技术不但耗时而且也不能应用 于新菌株的开发。近些年来，人们发现可以通过转移外源基因或内源基因来提高 红霉素的产量，但利用调控基因来提高红霉素产量的研究却鲜有报道(迄今只报 因而是调控基因。2007年，糖多孢红霉菌全基因组序列测序完成，该基因组中 有101个TetR家族转录调控子。TetR家族是一类在细菌中普遍存在的转录调控 家族，大都具有HTH的DNA结合结构域，且一般作为转录抑制子。基于近些 年来人们在链霉菌中发现了多株调控抗生素生物合成的TetR家族转录调控子 (rrdA、SC01 转录调控子中筛选参与红霉素生物合成的调控基因。 本研究通过糖多孢红霉菌染色体基因快速失活技术(即片段同源重组技术) 构建了SACE3446基因缺失突变体ASACE3446。首先我们以糖多孢红霉菌 A226基因组为模板，通过PCR技术分别扩增出SACE 3446基因两侧约1500bp 的上下游同源臂，并将SACE3446基因的上下游同源臂分别连接到质粒 resistance pUCTSR中硫链丝菌肽抗性基因tsr(tlliostreptongene)的两侧，构建出 tsr和SACE3446基因上下游同源臂的大片段，通过PEG介导的原生质体转化 技术将该片段转入到糖多孢红霉菌A226中；在30Thio的筛选下，A226 lxg／mL 基因组中SACE3446基因被tsr基因所取代，从而构建出SACE3446基因失活 3446。随后我们将ASACE 突变体ASACE 到R3M大斜面上，在30oC培养箱中恒温培养并观察突变株菌丝体的生长情况， 糖多孢红霉菌TetR家族转录调控子SACE一3446调控红霉素生物合成的研究 结果显示ASACE3446菌丝体生长情况与出发菌株A226的菌丝体生长情况类 似。另外，我们又将ASACE TSB液体培养基30oC发酵培养168h，通过发酵液的抑菌圈大小来初步突变体 分析红霉素产量的变化，结果显示ASACE3446发酵液的红霉素产量明显高于出 发菌株A226的红霉素产量。这些结果表明SACE3446不参与糖多孢红霉菌的 孢子形态分化，但可能参与红霉素生物合成的调控。 HPLC分析结果表明SACE 3446 ErA产量的提高仅仅是由于调控基因SACE3446缺失而引起的，我们将 SACE 3446基因亚克隆到可在大肠杆菌与糖多孢红霉菌中穿梭的质粒pZMW 中，通过PEG介导的原生质体转化技术将该质粒导入突变体ASACE3446中， 构建出回复菌株ASACE ASACE 一步验证SACE 3446基因的生物学功能，我们将表达型整合质粒pZMW3446 证明了SACE3446是参与红霉素生物合成的负调控基因。 为了探讨SACE3446基因与参与红霉素生物合成的全局性调控基因 bldD(既可以调控红霉素的产量又参与形态分化)之间的级联关系，本研究以bldD 缺失突变体AbldD为出发菌株，在其基础上中进一步失活SACE3446基因，构 建双突变株AbldD／ASACE3446，结果发现双突变株AbldD／ASACE3446的红霉 素产量比出发菌株AbldD的红霉素产量明显提高，而双突变回复菌株 AbldD／ASACE 素水平。这些结果表明SACE3446的靶基因可能位于bldD靶基因的下游。 为了推测SACE3446是普遍存在的可负调控红霉素生物合成的基因，我们 在工业菌株ZMD中失活SACE3446基因，结果表明在ZMD中失活SACE3446 同样可以提高红霉素的产量。由