LC3自噬双标腺病毒使用指南.pdfVIP

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3 ）使用 指南 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种 “自食（Self-eating）”的现象，凋亡是 “自 杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3 的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3 等融合蛋白来示踪 自噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此 我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬 (流) 的mRFP-GFP-LC3 腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3 ，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于 GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生 淬灭,此时只能检测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统 直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬 流研究不可或缺的利器。 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3 ）使用 指南 mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 （1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装； （2 ）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于 4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间 超过6 个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小 包装病毒产品（购买时请提出）。 （二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融 解，使用培养目的细胞 用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。 感染目的细胞 2 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3 ）使用 指南 由于腺病毒是自主复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传， 因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体情况具体对待。一般根据 外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒的时间，短时程处理（一周之 内）建议先感染腺病毒之后再进行处理，长时程刺激的建议在刺激结 束前2~3 天进行腺病毒感染。另外不同细胞的MOI 不同，所以在将 病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中 加入的病毒数。 （一）细胞准备 5 将状态良好的目的细胞接种到24 孔板，使细胞浓度为1×10 /ml 细 胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二 天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。 （二）病毒感染 I、贴壁细胞 由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算， 因此需要在 高倍镜下拍照，条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，此时需要把细 胞铺被在玻片上面（部分细胞铁壁能力不是很强，此时需要预先在玻 片上包被galetin甚至laminin ）。感染实验在1/2体积培养液感染 （详见下表格）。加入的病毒量范围在MOI=20～50 内 （具体感染的 操作量参见附录表格），每个MOI值加两个孔2小时后换液。