细胞支原体污染一般情况与预防措施.docVIP

细胞支原体污染一般情况及预防措施 细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。 各国细胞库支原体污染的统计表，如下：??????国家　 受支原体污染(%) 报告年度??????USA－FDA 15 1993(past 30 years)??????USA－ATCC 15-20 1992??????Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987??????Germany－DSM 36 1990-1994??????Argentina 65 1987??????Israel 32 1986-1993??????China 95 1990 造成支原体高污染率的原因为：???????1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）???????2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化???????3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式???????4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染???????5、研究或操作人员忽略污染问题 支原体污染了来源：??????1、已受污染的细胞???????2、操作人员的疏失???????3、已受污染的培养基、血清???????4、操作环境不良、实验器具不洁等 由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。 去除支原体污染：???????1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）???????2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine???????3、Anti-sera 预防与控制方面可从以下各点加强注意： 设备方面：???????1、使用已作支原体测试ok之细胞株???????2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞???????3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞? 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 有关支原体污染之问题与回答： 1、应如何避免细胞污染？??????细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？??????直接灭菌后丢弃之。 3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？??????不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 4、支原体污染会对细胞培养有何影响？??????支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？??????直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 支原体之检测： 直接培养法 ?原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每