流式细胞仪细胞分选的操作步骤.docVIP

细 胞 分 选 的 简 要 操 作 步 骤 一、上样前的准备 FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L 无菌PBS在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒 将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 用70%乙醇冲洗收集管接口处。 在收集管接口处安装支收集管。 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。按液流控制键RUN。 在Setup方框中打叉点击Acquisition Control菜单中Acquire。。 跑乙醇直至支收集管注满点击Pause，Abort。 重复上述步骤。 断开鞘液筒在鞘液筒中加入500mL 无菌，振摇鞘液筒，倒掉，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。 在鞘液筒中加入3L无菌，盖紧盖子。安好鞘液筒。 在收集管接口处安装支新的收集管。 放上一支装有无菌的进样管。 点击Acquisition Control菜单中Acquire。跑直至支收集管注满点击Pause，Abort。 重复上述步骤。 断开鞘液筒在鞘液筒中加入L 无菌盖紧盖子。安好鞘液筒。在收集管接口处安装支新的收集管。放上一支装有无菌的进样管。点击Acquisition Control菜单中Acquire。第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复操作至个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause，Abort。 在收集管接口处安装支新的收集管应用无菌技术，用无菌PBS/4 % BSA缓冲液包被50mL锥型管将包被好的锥型管安置于收集接口 按述分选步骤分选样本。 二、分选细胞 分选前应优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门。 进入CellQuest从菜单连机。 打开CellQuest中存储的获取窗口，打开优化后存储的仪器设置条件。 进样针处上样本管。 从Acquire menu选择Sort Setup。依据样本中目的细胞的百分比及实验目的决定分选模式Sort Gate中选择分选用的门，如选择No Gate（所有细胞）将只进行获取不分选Sort Count-中选择0连续分选Sort Mode中选择Single Cell、Recovery、ExclusionAborted Cell中选择显示排除细胞数。点击液流控制键RUN。 点击获取控制窗口Aquire。分选结束时点击Pause，Abort。取下样本管，换上1mL蒸馏水。点击获取控制窗口Standby。 取下收集锥型管。300g ( 5min），用培养液重悬，按实验所需条件进行培养。 三、上样后的清洗 分选结束后，为保证分选系统管路无腐蚀、无结晶、不堵塞、不染菌，必须进行管路的消毒与清洁，方法如下。且一旦开始进行分选实验后，每周必须开机对分选管路用无菌蒸馏水按照第一部分介绍的方法进行一次充分的冲洗。 应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制） 在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒 将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。 用70%乙醇冲洗收集管接口处。 在收集管接口处安装支收集管。 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。按液流控制键RUN。 在Setup方框中打叉点击Acquisition Control菜单中Acquire。。 跑乙醇直至支收集管注满点击Pause，Abort。 重复上述步骤。 断开鞘液筒在鞘液筒中加入500mL 无菌，振摇鞘液筒，倒掉，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。 在鞘液筒中加入3L无菌，盖紧盖子。安好鞘液筒。 在收集管接口处安装支新的收集管。 放上一支装有无菌的进样管。 点击Acquisition Control菜单中Acquire。跑直至支收集管注满点击Pause，Abort。 重复上述步骤。在鞘液筒中加入3L，盖紧盖子。安好鞘液筒。放上一支装有的进样管。