土壤中解磷细菌的分离与纯化李其帅林志军王栋栋周宏孟海青.DOC

土壤中解磷细菌的分离与纯化 （李其帅、林志军、王栋栋、周宏、孟海青、纪凯华） 生科05级2班 摘要： 磷细菌是存在于自然界，主要是土壤中的一类溶解磷酸化合物能力较强的细菌的总称。通过磷细菌的作用，可使土壤中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物。故又称溶磷细菌。主要有两类，一类称为有机磷细菌，主要作用是分解有机磷化物如核酸、磷脂等；另一类称为无机磷细菌，主要作用是分解无机磷化物，如磷酸钙、磷灰石等。磷细菌主要是通过产生各种酶类或酸类而发挥作用的。可用它制成细菌肥料，实践证明，对小麦、甘薯、大豆、水稻等多种农作物，以及苹果、桃等果树具有一定增产效果。农业上常用的菌有解磷巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium var．phosphaticum），俗称为“大芽孢”磷细菌，此外，还有其他芽孢杆菌和无色杆菌（Achromobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）等。 解磷细菌 无机磷细菌 含磷培养基 分离提纯 生理生化反应 实验目的 1）掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2）学习并掌握分离纯化无机解磷细菌的基本方法。 3）巩固和贯通所学的无菌技术、纯培养技术、保藏技术、显微技术、……等微生物操作技术。 4）学习通过微生物的形态特征、生理生化反应来鉴别解磷细菌与其他微生物的异同。 试验原理 1） 菌种来源：由于各种微生物对营养物质需求不同，在不同地方采样对选取所要的微生物含量和其它杂菌含量的多少直接有关。所以要选择无机磷含量较高的土壤中采样。 2） 培养基的选取：为了使所要的无机解磷细菌能生长，其它微生物生长受到一定的抑制，要用选择培养基。还要把解磷菌与其他微生物相区别，还要用鉴别培养基。为了达到即是选择培养基又是鉴别培养基，选取以磷酸钙为唯一磷源的培养基。这样又能起到选择培养的目的，又能通过有无解磷圈鉴别无机解磷细菌。 3）培养及分离纯化：通过涂布培养法、平板划线法等方法达到分离纯化的目的。 4）保藏：通过分离纯化得到的菌种，接种与斜面培养基上，到一定时间后进行传代培养保藏，使其不死亡、减少突变所引起的生物学性状的改变。 5）通过形态与染色鉴定：由于各种微生物有其特定的菌落形态特征和单细胞形态特征，可通过这些形态进行鉴定。还由于细胞壁组成不同可进行鉴别染色法进行鉴定，也可用产生不产生芽孢进行芽孢染色。通过以上方法可对所分离纯化的菌种进行初步的鉴定。 6）通过生理生化反应进行鉴定：各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异，如表现在对对大分子糖类和蛋白质的分解能力，以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们有不同的酶系。我们在实验室允许的条件下做了糖类发酵与氧化、是否能产生过氧化氢酶以及是否含有细胞色素氧化酶等生理生化试验，进行再次鉴定。 用品器材：洁净试管 培养皿500ml和250ml锥形瓶各一个，玻璃珠 高压锅 10ml和100ml量筒 1ml移液枪配枪头 牛皮纸 玻璃涂棒 接种环显微镜 酒精灯 载波片 盖玻片 擦净纸 双层瓶（香波油 二甲苯） 试管架 等 无菌水 碱性美兰 石炭酸复红染色液 结晶紫 碘液 乙醇 番红 5%孔雀绿水溶液 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液。1%α-萘酚－乙醇溶液。0.2%, 磷酸二氢钾0.03% 氯化钠0.5% 糖1% 琼脂 0.5~0.7% 溴百里酚0.003%。 PH 7.0~7.4 分离纯化 1 配置培养基和灭菌 根据上述培养基成分，到药品室找到相应材料，用天平称量，加到500ml锥形瓶中，玻璃棒搅拌均匀（必要时加热），塞上棉塞，双层牛皮纸扎好口；试管塞上棉塞，用牛皮纸7个扎一捆；平皿6个一包，牛皮纸扎好，将它们同移液枪、玻璃珠、玻璃涂棒、量筒、100ml图锥形瓶放入高压锅进行高压蒸汽灭菌 ：121摄氏度下 20分钟。待用。 2 在点燃的酒精灯附近将培养基倒入平皿，冷却制成9个平板，待用 3 取样并制备土壤稀释液 找一处含沙质较多的土壤，靠近植物根部取其表层5cm以下的土适量于塑料袋中带回实验室。称出10克于带有无菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，用已灭菌的量筒量取90ml无菌水溶解，振摇约20分钟，使土样与水充分混匀。 点燃酒精灯在火焰附近，用无菌移液枪从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液枪从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀释度的土壤溶液 4 涂布。 将上述 9个平板分别贴上标签