扫描电镜生物样品的快速制备方法研究.pdf

扫描电镜生物样品的快速制备方法研究 47 扫描电镜生物样品的快速制备方法研究 徐柏森 　冯 　汀 　刘 　刚 (南京林业大学电镜室 　南京 　210037) 摘要 　本文通过改进菌类和纤毛等娇嫩样品在临界点干燥前的制备程序和适当的缩短梯度脱水的时间 ,使采 用戊二醛单固定处理的样品达到双固定的效果 ,提高了部分生物样品的制备质量 ,为制备娇嫩的扫描电镜样 品提供了一条简易而快速的制备方法。 关键词 　扫描电镜 ;样品制备 ;临界点干燥 在扫描电镜样品制备中 ,对娇嫩的样品采用没有表面张力作用的临界点干燥法 ,并在干燥前作 戊二醛和 　酸双固定处理是保存生物样品真实形貌的优秀方法。但此方法操作复杂 ,做一批样品 要花 7～8 小时 ,且后固定的 　酸价格昂贵 ,必须依靠进口。为此 ,改进制样方法已越来越受到国内 外电镜工作者重视。有关资料表明 ,单用戊二醛固定的样品 ,在酒精脱水过程中容易产生较大的收 缩 ,对保存样品的形态不利[1 ] 。笔者仿效丰岛等人的方法[2 ] ,用鱼肝脏作戊二醛固定后的酒精系列 脱水试验时发现 ,样品的收缩率与脱水时间有很大关系 ,脱水时间越长 ,收缩越大 ,反之 ,则越小。 尤其是样品直接进行 70 % - 90 % - 100 %的酒精脱水时 ,每步在 5 分钟以下则几乎没有收缩。将 此程序应用于临界点干燥的制备方法 ,其中以每步脱水 5 分钟的效果最佳 ,有些样品甚至比常规方 法制备的质量更好。近年来 ,我室已将此方法多次用于菌类等生物样品的制备之中 ,效果显著 ,现 报道如下。 1 　材料和方法 1. 1 　材料 　选用活杀的雄鸡喉部气管、接种培育 15 天的白酱菌孢子、黑曲霉孢子和木霉菌丝。 1. 2 　方法 　实验共分 4 组 ,第一组为常规对照 ;第二组为快速的双固定法制备 ;第三组、第四组均 ( ) 采用戊二醛单固定半小时 ,脱水和置换时间分别为 5 分钟和 2 分钟 见表 1 。以上四组样品处理 后用 CO2 临界点干燥仪干燥 ,喷镀和用 SEM 观察。 2 　结果和讨论 　　从观察结果看 ,第一组常规对照的图象清晰 ,结构保存完好 ,能够满足 SEM 的观察需要。第二 组用快速的双固定法制备的样品结果与对照组一致。第三组为单固定后每步 5 分钟的方法制备 , 效果良好。鸡气管的纤毛排列自然 ,表面组织清晰可见 ,与对照组效果一致 ;而白酱菌的效果则比 对照组好 ,孢子颗粒明显比对照组饱满。第四组为单固定后每步处理 2 分钟的方法制备 ,效果不理 想 ,鸡气管的纤毛有倒伏 ,上皮组织不清晰 ,孢子边缘不清楚。 　　　　　　　　　　　　　　　中国野生植物资源 　　　　　　　　　　第 19 卷第 6 期 48 表 1 　扫描电镜生物样品制备程序 第 2 组 第 3 组 第 4 组 第 1 组 步骤 双固定快速 单固定快速 单固定快速 常规对照 处理 5 分/ 次 处理 5 分/ 次 处理 2 分/ 次 4 %戊二醛固定 2 小时 30 分钟 30 分钟 30 分钟 0 . 1M 磷酸 15 分/ 次 ×3 5 分/ 次 ×3 / / 缓冲液清洗 1 %O O 固定 2 小时