邻苯二酚双加氧酶的功能.PDFVIP

微生物学通报 Jul. 20, 2017, 44(7): 1513−1524 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170100 研究报告 三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C 中多个 邻苯二酚双加氧酶的功能 * 李朔 许楹 周宁一 ( 200240) 摘 要：【目的】研究Sphingomonas sp. YL-JM2C 菌株的生长特性，确定以三氯卡班作为碳源的 生长情况。挖掘菌株YL-JM2C 潜在的邻苯二酚 1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，在 大肠杆菌(Escherichia coli) 中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化 S. sp. YL-JM2C 菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件，并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株 生长情况，绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因，并分别在 Escherichia coli BL21(DE3) 中进行异源表达，通过AKTA 快速纯化系统纯化蛋白，分别以邻苯二 酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH 为7.0−7.5 时生长最 优。在以浓度为4−8 mg/L 的三氯卡班做为底物时，菌株适宜生长。当R2A 培养基仅含有0.01% 酵母提取物和无机盐时，加入终浓度为4 mg/L 的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6 个潜在的 邻苯二酚双加氧酶基因 stcA1 、stcA2 、stcA3 、stcE1 、stcE2 和 stcE3 ，表达并通过粗酶液分析证 明其中5 个基因stcA1 、stcA2 、stcA3 、stcE1 和stcE2 编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻 苯二酚双加氧酶的活性；纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2 和StcA3 均属于II 型邻苯 二酚 1,2-双加氧酶，StcE1 和 StcE2 为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶；它们酶动力学分析研究 证明了 5 个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高，4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中 发现了5 个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因，stcA1 、stcA2 和stcA3 编码的酶均属于II 型邻苯 二酚 1,2-双加氧酶，stcE1 和stcE2 为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5 个酶均具有催 化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能，这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍 生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。 关键词：鞘氨醇单胞菌YL-JM2C ，三氯卡班，邻苯二酚，3-氯邻苯二酚，4-氯邻苯二酚，邻苯二 酚1,2-双加氧酶，邻苯二酚2,3-双加氧酶 Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. *Corresponding author: Tel/Fax: 86-21 E-mail: ying.xu@ Received: February 08, 2016; Accepted: March 22, 2017; Published online () : April 05, 2017 基金项目：(No. 3137009431570100) *通讯作者：Tel/Fax 86-21E-mail ying.xu@ 收稿日期：2016-02-08 ；接受日期：2017-03-22 ；优先数字出版日期() ：2017-04-05 1514 微生物学通报 Micro