GST融合蛋白纯化步骤.docVIP

GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6494770.html) PBS缓冲液; 2.加入 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6267667.html) 溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2% HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6272887.html) TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6489743.html) DNase和 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6288693.html) RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g 6.上清转移到一只新试管，加入 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6417817.html) DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50% HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_7685799.html) 谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS; 3.沉淀中加入10倍标准体积的 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6494770.html) PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用 HYPERLINK javascript:redirect(http%3A///pdshowtwo/productshow_6288714.html) 凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。