实时荧光定量pcr的技术原理应用和实践第二代染料.pptVIP

通过实验选择Housekeeping gene 实测多个备选Housekeeping gene 以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性 参考资料 geNorm 网站 - http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/ Vandesompele et al., Genome Biology, 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes Master mix的优化DNA聚合酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704 Master mix的优化荧光染料 新型荧光染料(SuperGreen) 激发、发射波长与SYBRgreen近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析 化学性质更稳定 致突变性与