12、血清谷丙转氨酶活性测定.pptVIP

血清谷丙转氨酶活性的测定（King法）;【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。;【原理】 生物机体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α－酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase , GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。 ;血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：; 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。;囱滥甜氟侍激器炉拓邓郊提缸炳入舍伍或限作处横爸阉备柬贷组袖冬斜紧12、血清谷丙转氨酶活性测定12、血清谷丙转氨酶活性测定; King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。;试剂与器材 ;4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L） 称 2，4－二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 5) 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至 100mL。此溶液浓度为 2μmol/mL，临用前配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。 3、器材 试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL），量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光光度计，坐标纸。 ;实验内容和步骤;2) 绘制标准曲线 ;; 结果计算 ;着栖都戒斡露熔阀烁包鸣啼逐斤边邑上执动社掇拎挪廊圾陆痕攻孙士招湿12、血清谷丙转氨酶活性测定12、血清谷丙转氨酶活性测定; 比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表???酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。;改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度