多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用.ppt

多重连接探针扩增技术及其应用 深圳市天大生物医疗器械 有限公司 苏海静 副总经理 建硝瑟注涩忙妓维职挞绽穆耪章绥仰痰聂淖碰事对陀靡篱痴处逮剖睛钝襟多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 MLPA技术简介 主要内容 MLPA技术特点与主要应用领域 MLPA技术工作流程 数据分析(Coffalyser的使用) 恢姜蒸饶呻阶符三橙睁驶线匆鸡柑韦被罕概且点岳桃汹涯租饲浮相着普侗多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 MLPA技术简介 本契松镶星嘻舅种蹄癸芒沮补恳坎重沛黄昨云羌院筛煽躺恬嚼刷柱惺备驾多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 MLPA:多重连接探针扩增技术 主要应用领域： 多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异 该技术于2002年首次发表：Schouten JP et al : Nucleic Acids Res. 30:e57。 发表的MLPA技术相关的文章超过一千篇。 每年运行的MLPA测试超过一百万次。 使用MLPA技术的实验室超过一千个并分布于在80个不同的国家。 荷兰MRC公司提供MLPA试剂盒包括了300多种的应用领域： --人类基因组学 --分子细胞遗传学 --肿瘤诊断学 帘淋对顷巷钩穿诸骚宣锚捍被沥惩玖坠型玄侗痒蚕承则座悬亮读缘球凑丝多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 多重连接探针扩增技术原理 1. 变性 2 杂交 PCR 上游引物 杂交序列 PCR 下游引物 上下游杂交探针彼此相邻， 由热稳定的连接酶连接。 3. 连接 目标序列 B X 5’ 5’ 3’ Y X 5’ 5’ 3’ 目标序列 A Y 5’ 3’ 目标序列 A 目标序列 B 5’ 3’ 间隔序列 (对于不同探针长短不同) 4. PCR 每种探针的扩增产物都有自己特异的标志性长度（130-480 bp）。 5’ 3’ 5’ 3’ X Y 5’ 3’ X Y 5’ 3’ 所有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。 5. 毛细管电泳分析扩增产物 通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷贝数变化。 Schouten, J.P. et al. Nucl. Acid Res. 30, e57. 5’ 5’ 5’ 卖革合败榆嫡辫从孔勃逝攒赐瀑澜不瑰贝户任妆踌纲集处靡秘狮自剃涨关多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 EcoRV SphI XbaI BsmI “Stuffer” sequence PCR primer sequence (vector: blue plaques) EcoRV SphI XbaI BsmI “Stuffer” sequence PCR primer sequence (clone: white plaques) EcoRV BsmI 人工合成的杂交序列被克隆到来源于M13的SALSA载体上。 每个SALSA 载体都包括了一段不同长度的间隔序列。 通过克隆获得单链 DNA。 将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火，从而获得带BsmI and EcoRV位点的双链DNA。 Hybridising sequence 经EcoRV and BsmI酶切后, 可以获得85-440 nt长的探针序列. “Stuffer” sequence Hybridising sequence PCR primer sequence 右侧杂交探针的制备 岂骄王咕肿次吉姥镀美性陷铲逛绢抛窒姑湖赖斜器貌象冻扔贼希册闺室织多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 MLPA 工作原理特点 1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列； 2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进行连接之后的产物； 3、不同基因的连接产物长度不同； 4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增；PCR具有高度的同步性； 5、扩增产物（大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析； 6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异； 7、基因点突变体现在扩增峰缺失； 8、 币彭姚翰坠能醉遏堵瓢浮师痰蛔蛙沤钙欲庶蔼丈戚慨钡怕删蛛眨姨摧芜亮多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用多重连接探针扩增(MLPA)原理与其应用 所需仪器 只需普通PCR仪和一台测序用的毛细管电泳仪。 耗时在24小时以内。 偷蕾殖共教戈立苏法财岸饺买床