番茄抗性相关基因SlHin1 的克隆、表达与抗病毒功能 - 中国农业科学.PDF

中国农业科学 2017,50(7):1242-1251 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.007 番茄抗性相关基因 SlHin1 的克隆、表达与抗病毒功能 彭浩然，潘琪，魏周玲，蒲运丹，张永至，吴根土，青玲，孙现超 （西南大学植物保护学院，重庆 400716 ） 摘要：【目的】克隆番茄抗性相关基因SlHin1 （harpin-induced gene 1），分析其生物信息学特征、组织表 达和亚细胞定位情况，研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用，为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通 过 RT-PCR 及基因克隆方法，从番茄总 RNA 中克隆得到基因 SlHin1；应用生物信息学方法分析其 DNA 序列及其编 码的蛋白序列特性，使用MEGA6.0对SlHIN1 氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对，并构建同源物种间系统进 化树；将该基因片段通过 Sal I和 Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-mGFP-C1，采用GFP标记的方法进行亚 细胞定位检测，分析编码蛋白表达位置；利用实时荧光定量 RT-PCR（qRT-PCR）分析该基因在番茄不同组织的表 达量水平；将该基因片段通过 Nco I 和 Bam HI 通过双酶切连接至植物表达载体 pFGC5941，用土壤农杆菌 EHA105 瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆，以检测植株对病毒的抗性变化，间接ELISA 法检测病毒的含量，探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】 利用 RT-PCR 方法从番茄材料（Solanum lycopersicon cv. Ailsa Craig）的叶片组织中克隆得到全长为 675 bp 的番茄抗性相关基因 SlHin1，将序列分别提交至GenBank，得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表 明，其基因预测编码225个氨基酸，分子量为26.1 kD，理论等电点为9.35，结构上具有LEA-14保守结构域，不 具有跨膜区段，并且位于番茄基因组 10 号染色体上（Solyc10g081980）；多序列比对及进化树分析表明，该基因 编码的蛋白与茄科植物 HIN1 氨基酸同源性 80.0％以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远；亚细胞定位 显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致；qRT-PCR结果分析表明该基因具有组 织特异性，表达量在根、叶、茎间依次降低；在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的 烟草花叶病毒侵染性克隆，处理组本氏烟在接种病毒 4 d 后没有任何荧光出现，而对照组出现绿色荧光。随着接 种时间推移，接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大，而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA 检测病毒含量较对照组少，处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明，显色后的硝酸纤维素膜上 约在 26 kD 处有一特异条带，而空载体的对照无相应条带，说明 SlHIN1 蛋白在注射部位成功表达。【结论】 Hin1 在供试科植物中均存在，其中SlHin1定位在细胞膜，过表达该基因可抑制病毒扩散，推测其可能参与茄科植物对 烟草花叶病毒的抗性反应，使植株获得抗性。 关键词：番茄；SlHin1；烟草花叶病毒；表达；抗病毒 Cloning, Expression and Anti-Virus Function Analysis of Tomato Resistance-Related Gene SlHin1 PENG HaoRan, PAN Qi, WEI ZhouLing, PU YunDan, ZHANG YongZhi, WU GenTu,