纸片法药敏试验失败的原因分析及解决措施.docVIP

　　纸片法药敏试验失败的原因分析及解决措施 王林果 康娟/ 普莱柯生物工程股份有限公司 兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数兽医临床实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前兽医临床应用较多的方法是纸片法，以下针对该法进行分析。 一、问题的提出 按照标准操作程序进行操作，测量出抑菌圈大小，根据药敏实验标准进行判读，获得比较敏感的药物，现场使用常常出现敏感药物得不到良好的治疗效果，或者药敏实验不敏感的药物在现场使用却能获得较好的治疗效果，这是很多从事兽医实验室工作的兽医想不明白的，是不是药敏试验做错了？还是药物是假药？又或者是药敏试验本身就不靠谱？一堆的问号让兽医工无所适从，那么究竟为何会有这样的结果，有了这样的结果如何改善？ 二、问题分析 1. 药敏实验步骤（纸片法）。（1）无菌采集合适的病料组织，无菌接种培养皿或者肉汤进行再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h 增菌。（2）在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。（3）用无菌镊子将纸片（提前制备好）放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24 mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5 ～ 6片。（4）标记每种药敏纸片的名称。（5）贴完纸片的平皿15 min 后再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h，观察记录结果。（6）结果判读：以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。 2. 影响药敏试验结果的因素。 （1）实验本身因素。 培养基：①培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。②倾注平板时，厚度应合适（约5 ～ 6 mm），不可太薄，一般90 mm 直径的培养皿， 倾注培养基18 ～ 20 ml 为宜。③培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP 的活性。④市场提供的药敏试验的培养基缺乏严格质控，质量难以保证，建议采购质量过硬的产品或者自制培养基。 细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。 药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。市场售卖的药敏纸片缺乏严格质控，质量难以保证，建议按要求自制药敏纸片。 培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12 ～ 24 h，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2 ～ 4 h，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。 （2）兽医人员的因素。 操作的问题：①标准的药敏试验需要先进行细菌的分离培养，故药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。目前常规基层兽医实验室都采用自创的简便方法（无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1 ∶ 5 加生理盐水研磨制成悬液，静置5 min，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5 min 后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小），这个方法可以快速获得结果，但结果往往也出现误差，原因一是细菌量较少，二是污染的问题很难排除，结果不一定是临床细菌所致。②自制药敏片无法保证每一片纸片所含药物有效成分均一，导致结果出现误差，建议采用牛津杯法进行实验，用精密的移液枪可以量化每个牛津杯中的药物含量。 对每种药物的药动学一知半解：在选择高敏药物时没有考虑药物的吸收途径。药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，故在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。例如新霉素肠道吸收较差，可以引起高浓度的肠道药物浓度，治疗肠道疾病是非常好的药物。 误诊、滥