601- 北京梅科万德生物科技有限公司.DOC

HRP标记试剂盒 产品编号：601 活化HRP的醛基与IgG抗体的氨基反应形成酰胺键，从而将HRP标记到IgG抗体上。 本试剂盒提供了标记0.1～2mgIgG抗体。 规格 试剂盒组分 活化HRP：1mg 5支。 标记缓冲液5ml。 反应增强剂1支。 4. 储存液1000μl。 试剂盒不提供需要自备或单独购买的材料和设备 1. 超滤管4ml（MWCO=10K）1支 。 运输、储存和有效期 收到产品后将置于-20°C. 有效期1年 操作方法 IgG的准备 1.1.检查IgG是否适合标记，见考表1. 表1. 待标记抗体与标记试剂盒的兼容性 成分 是否适合标记和所需处理 叠氮钠 置换缓冲液（步骤1.2）（叠氮钠可使过氧化物酶失活） 甘油 10%以下，继续进行步骤2（低含量的甘油对标记的影响可以忽略） 大于10%，置换缓冲液（步骤1.2）（甘油含量过高,影响标记效率） Tris 置换缓冲液（步骤1.2）（Tris所含氨基与酶反应，影响抗体标记） 甘氨酸 置换缓冲液（步骤1.2）（甘氨酸所含氨基与酶反应，影响抗体标记） BSA或明胶 4xIgG(μg量)：继续进行步骤2（杂蛋白控制在一定浓度下标记可以接受） 高于4xIgG(μg量)：不能标记，需纯化IgG（杂蛋白含量太高，严重影响抗体标记） 腹水 不能标记，需纯化IgG（杂蛋白含量太高，严重影响抗体标记） 血清 不能标记，需纯化IgG（杂蛋白含量太高，严重影响抗体标记） 杂交瘤上清 不能标记，需纯化IgG（杂蛋白含量太高，严重影响抗体标记） 如果是购买的抗体，请向供应商了解内含成分。不含稳定剂的抗体可获得最佳标记效果，BSA或明胶低于4倍IgG μg量，甘油不高于10%可以可以直接进行标记。抗体中含有Tris, 甘氨酸或过多的甘油，首先要进行缓冲液的置换，去除这些成分。如果含有的BSA或明胶超过4倍IgG的μg量，或是血清、腹水和杂交瘤上清液，需要先纯化IgG，可用蛋白A亲和层析柱或其他纯化试剂。 抗体的适宜浓度是1～10mg/ml，,抗体浓度高，标记率高，低于此浓度会明显降低标记率，需要进行浓缩操作。 1.2. 抗体浓缩和液体置换 1.2.1.在超滤管中加入适量的抗体溶液，14000g离心，超滤管中残留的部分为浓缩抗体。 1.2.2.如果操作目的是浓缩抗体，继续操作1.2.3，如果目的是去除干扰标记的分子，加反应缓冲液于超滤管中，14000g离心，直到抗体浓缩到浓度在1~10mg/ml。 1.2.3.在超滤管中加入适量的标记缓冲液，使抗体的浓度为1～10mg/ml, 用移液器不断洗吹膜上的蛋白质使之混匀，注意不要刺到膜。 1.2.4．将抗体溶液转移到装有活化辣根过氧化物酶的管中。 2.抗体标记 2.1使用浓度1~10mg/ml抗体进行标记，取抗体1mg(相当于100~1000μl如果抗体是冻干的，加入适量的标记缓冲液)于活化HRP的管中，混匀，加入100μl的标记缓冲液。 2.2室温、避光孵育3小时，在床上摇动。 2.3加反应增强剂到标记反应管中。 2.4涡旋混匀，室温黑暗孵育15分钟。 2.5加100μ储存液到反应管中。 2.9涡旋混匀，室温黑暗孵育15分钟。 2.10抗体已标记好，可以直接使用；也可用超滤管进一步纯化。如长期保存，可加等量甘油，混匀后-20℃保存。 注意事项 1.叠氮钠是HRP的抑制剂，因此，避免使用叠氮钠作为缓冲液和HRP标记物的防腐剂。 2.标记操作中HRP与IgG的摩尔比为4:1，可以通过增加或减少摩尔比可以增加或降低标记率。 3.同样量的抗体，减少反应体积（相对增加反应浓度）可以增加反应效率。 4.标记后通常可以直接使用。HRP结合物的进一步纯化可以降低非特异反应。非结合HRP可以通过凝胶过滤或亲和层析的方法除去。 北京梅科万德生物科技有限公司 地址：北京市海淀区西小口路27号西三旗生态园商服北楼2203号