分离胶浓缩胶样品缓冲液.PPT

是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。 层析技术分类 常用的层析原理 1.分配层析——纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（酚） 纸层析 纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。 2 离子交换层析 原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯） 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+ 阴离子：Cl-、OH- 示意图（交换树脂表面） 示意图（离子交换过程） 电离基团（磺酸根） 示意图 3 吸附层析 原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。 吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。 在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用 吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。 吸附层析示意图 吸附剂 4 亲和层析 原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。 专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体 载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。 5 凝胶过滤 原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。 凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。 三、电泳技术基本原理 1.基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动; pH pI分子带正电荷,在电场中向负极移动; 泳动率 2.影响电泳速度的因素 (1) 电场强度 泳动速度与电场强度成正比 常压电泳(100—500V). 2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 四、几种常见电泳的比较 五、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理 1.原理 具有电泳和分子筛的双重作用 2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合 单体：丙稀酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis) 催化剂 聚合形成的三维网状结构。 催化剂 （1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制 3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径 凝胶越浓T?，凝胶孔径↓，所受阻力?，机械强度? 丙稀酰胺浓度 分离物质分子量 4％ 大于100万 7－7.5％ 1－100万 15－30％ 小于1万 胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好 凝胶强度的选择 先用7.5%的