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减毒活菌卡介苗对哮喘TLR4表达影响【摘要】 目的 观察减毒活菌卡介苗(BCG)对哮喘小鼠肺组织TLR4表达的影响，以探讨BCG对哮喘治疗的可能作用机制。方法 昆明小鼠建立哮喘模型并多次BCG接种，Western Blotting 检测肺组织TLR4的表达。结果 BCG干预组小鼠TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比增强。结论 卡介苗对哮喘的治疗作用可能与肺组织TLR4上调有关。? 【关键词】 卡介苗；哮喘；TLR4 哮喘存在有气道高反应性、Ig?E调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白，命名为TLR，最初发现的TLR4是目前研究最多的??［1］?。研究证实，BCG其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合,促进巨噬细胞产生IL?12、IFN?γ,抑制IL?4、IL?5的产生,从而纠正哮喘中Th1/Th2亚群数目和(或)功能失衡??［2］?。本实验意在研究BCG对哮喘小鼠模型中肺组织TLR4的影响，为临床哮喘治疗提供新的研究方向及思路，并将发现以TLRs和其信号途径作为靶点去治疗、干预多种疾病的新方法。? 1 材料与方法? 1?1 实验动物与试剂 昆明种小白鼠、卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)、减毒活菌卡介苗(BCG)、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。? 1?2 实验动物的分组及致敏模型制备 实验动物随机分为三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和BCG干预组，每组10只小鼠。哮喘发病组：第1、7、14天腹腔注射0?08%OVA致敏，每次0?2 ml，Al(OH)??3?作为免疫佐剂。第15天开始雾化激发；BCG干预组：哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前1 d和最后雾化激发1 h内BCG皮内注射再次干预，每次剂量为0?025 mg；空白对照组：用生理盐水代替OVA。所有小鼠在最后一次激发24 h后获取标本。? 1?3 小鼠肺组织TLR4蛋白的Western Blotting 检测 取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDS?PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2 h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，4℃孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X?光胶片感光检测蛋白信号。? 1?4 统计学方法 所有实验结果采用SPSS10?0软件进行统计分析，计量数据以（x±s）的形式表示。组间差异采用t检验。? ? 图1 各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达的Western Blotting鉴定? 1为空白对照组，2为哮喘发病组，3为BCG干预组，GAPDH蛋白为内参照 ? 2 结果? TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4 蛋白的表达量较对照组略有升高，而BCG干预组中TLR4 蛋白的表达量较前两组均有显著的增强(灰度分析数据未显示)。? 3 讨论? BCG为结核杆菌的减毒活疫苗,其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实??［3］?，TLR4的配体结合TLR4后，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，其中TLR4?NF?KB信号途径参与细胞免疫应答、炎性反应和抗凋亡相关基因的转录是细胞免疫学领域的研究热点。但BCG是否也能通过TLR4途径介导并激活Th1 型免疫反应尚不清楚。? 我们通过实验发现经BCG干预后，TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。BCG可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Th1/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。而关于BCG作为TLR4的配体如何发挥功能仍需进一步的实验研究验证。? 参 考 文 献? ［1］ Mikko Hallman，Mika R met，et al?Toll?Like Receptors As Sensors Of Pathogens?Pediatric Research,2001,50(3)?? ［2］ I?S?Choi,Y?I?Koh?Effects of BCG revaccination on asthma?Allergy,2003,58:1114?1116?? ［3］ An De Creus，Masanori Abe,et al?Low TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endot