发育期大鼠反复痫性发作后远期学习记忆障碍及海马神经元可塑性探究.docVIP

发育期大鼠反复痫性发作后远期学习记忆障碍及海马神经元可塑性探究[摘要] 目的 探讨发育期大鼠反复痫性发作对大鼠成年后学习记忆及海马神经元可塑性的影响。方法 生后10 d SD大鼠32只,随机分为实验组16只和对照组16只。实验组用戊四氮(PTZ)反复腹腔注射5 d,制成反复痫性发作模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。在生后第60天用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能,用RT-PCR方法检测大鼠海马神经元可塑性标志物神经生长相关蛋白-43(GAP-43)mRNA的表达变化。结果 与对照组比较,实验组在Morris水迷宫测试中平均逃避潜伏期明显延长(P0.05),原平台所在象限的游泳时间明显缩短(P0.05);海马组织GAP-43 mRNA的表达显著增多(P0.05)。结论 发育期大鼠反复痫性发作可引起远期学习记忆损害及海马神经元激活和突触重建等神经元可塑性改变,而GAP-43表达增多可能是学习记忆功能和可塑性变化的分子机制。 [关键词] 癫痫;发育;学习记忆;神经生长相关蛋白-43;可塑性 [中图分类号] R742.1;Q421 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2009)05-0333-04 对成年动物的研究发现,反复痫性发作可引起海马神经元坏死、代偿性苔藓纤维发芽,导致突触重组,形成异常通路,造成学习、记忆和行为的长期缺陷[1]。未成熟脑处于不断生长发育、功能逐步完善的动态变化之中,与成熟脑有很大的区别,目前对于发育鼠的研究国内外报道尚少。本研究以戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)诱导生后10 d大鼠建立反复痫性发作模型,追踪至大鼠成年后用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能,用RT-PCR方法检测大鼠海马组织神经元可塑性标志物神经生长相关蛋白(neuronalgrowth associated protein,GAP-43) mRNA的表达变化,探讨发育期大鼠反复痫性发作可否引起远期学习记忆损害及海马神经元激活和突触重建等神经元可塑性的改变,并探讨可能的分子机制。 1 材料与方法 1.1 材料及仪器 PTZ(美国Sigma公司);GAP-43、GADPH引物由上海生物工程公司合成,序列如下:GAP-43上游引物5′-ATGATGCTCCCGTTGCTGAT-3′,下游引物5′-GCACATCGGCTTGTTTAGGC-3′,产物片段长度276 bp;GADPH上游引物5′-CGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3′,下游引物5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′,产物片段长度358 bp;RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promega公司);Taq酶(日本TaKaRa公司);大鼠Morris水迷宫(中国药科大学)。 1.2 动物分组及模型制备 生后10 d健康清洁级SD大鼠32只(由东南大学医学院实验动物中心提供,12 h光亮/黑暗条件,22～25 ℃环境温度,由母鼠喂养,每窝崽数不超过10只),随机分为PTZ模型组16只和生理盐水对照组16只。参照文献[2]提供的方法,模型组首次腹腔注射惊厥阈下剂量PTZ 40 mg#8226;kg-1,10 min后注射20 mg#8226;kg-1,以后每10 min注射10 mg#8226;kg-1,直至出现4级以上的惊厥发作(发作的严重程度按照Lado幼鼠癫痫发作分级标准[3]:0级,无发作;1级,机械性咀嚼;2级,连续性点头;3级,单侧前肢阵挛;3.5级,前肢交替阵挛;4级,双侧前肢阵挛、后退;5级,双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6级,狂奔嘶叫;7级,强直发作),如此反复注射5 d。对照组给予腹腔注射等量的生理盐水。 1.3 Morris水迷宫测试 大鼠进入成年(第60天)后,对模型组16只和对照组16只行Morris水迷宫测试,连续5 d,以评价其空间学习和记忆能力。程序包括:(1)定位航行实验:用于检测大鼠对水迷宫的学习和记忆能力。历时4 d,每天8次,将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中,记录大鼠从入水到爬上平台所需的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在120 s内不能找到平台,就将其引至平台,将逃避潜伏期记为120 s。每次放大鼠入水前都要将其放在平台上停留30 s,使其熟悉水迷宫周围的标志物,以便记忆平台的位置。每次训练间隔60 s,取8次的平均值进行统计。(2)空间探索实验:用于检测大鼠学会寻找平台后对平台空间位置的记忆能力。定位航行实验结束后撤除平台,然后将大鼠任选一入水点放入水中,测其120 s内在原放有平台的象限内停留的时间。 1.4 用RT-PCR检测海马组织GAP-43mRNA的表达 完