在心脏组织表达一个人类新基因.docVIP

在心脏组织表达一个人类新基因摘要:KRAB/C2H2型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子.初步克隆了一个新的人类KRAB/C2H2型锌指蛋白基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF569.此基因在基因组DNA上长约56.28kb.定位于19q13.12.ORF全长2061个碱基,含6个外显子,5个内含子,编码一个长686个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白包含一个KRAB结构域和18个锌指结构域.Northern杂交结果表明,ZNF382mRNA在早期胚胎时期就开始表达,在不同时期人类胚胎组织中广泛表达,包括脑,心脏,肝和骨骼肌.在成人组织中重点表达在心脏,在肝,胰和骨骼肌中也有表达,其结构和表达特征预示着ZNF569在心脏发育和功能的发挥起着潜在的作用. 关键词:ZNF569;心脏发育;KRAB/C2H2;克隆;表达 中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号: 人类基因组估计有300-700个锌指蛋白,它们都具有锌指结构域,而C2H2型占绝大多数,此种锌指蛋白含有大约28个氨基酸的重复锌指序列,并由2个半胱氨酸残基和2个组氨酸残基螯合一个锌离子构成,此结构域能结合到特异的DNA识别位点,激活或抑制基因的表达[1].有1/3的C2H2型锌指蛋白同时具有一个KRAB框,此结构域位于锌指蛋白的氮末端非锌指区域,由A框和B框组成,折叠成?-2螺旋参与蛋白质和蛋 基金项目:国家自然科学基金、湖南省教育厅一般项目 作者简介:黄欣琼,第一作者(1980.9.省略,电话:0734-8281388通讯作者:唐显庆,副教授) 白质之间的作用,这种作用大部分是通过与转录中介因子2TIF1相互作用实现的[2].研究表明锌指蛋白在生物发育过程中充当持家基因或调节因子的角色,起着多方面的作用.如ZNF174是某些生长因子基因的负调节子[3],AJ18参与骨的发育[4].许多锌指蛋白参与某些肿瘤的形成,如WT1[5]. 本文利用同源基因和5RACE法克隆了KRABΠ/C2H2型锌指蛋白家族的一个新基因,经国际人类基因命名委员会批准命名为ZNF569. 1材料和方法 1.1cDNA文库的构建 用传统酚Π氯仿抽提的方法从人类胚胎的心脏组织中提取总RNA500μg,用RapidmRNATMpurificationKit(AMRESCO)分离纯化mRNA,以此mRNA为模板,使用TaKaRa公司的cDNASynsisKits和cDNAPCRLibraryKits反转录得到第1条cDNA链,在此基础上合成第2条cDNA链并使其平滑化,经酚Π氯仿抽提、连接、cDNA扩增,获得人类胚胎心脏组织的cDNA文库. 1.2ZNF569基因的克隆 以本实验室提取的心脏mRNA反转录所得的cDNA文库为模板,根据C2H2型锌指基因及相应未知EST序列设计引物P1和P2,其序列分别为P1(5’-AAGAGGAAATGACTGAGTCCCAGGG-3’),P2(5’-TCCTCTGGTGTCTAAC AAGGTGCGA-3’)进行PCR扩增,反应条件为:94℃4min一个循环,(94°C30s,52°C30s,72°C2min)30个循环,72°C8min所得PCR产物与克隆载体pMD18-T16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5,涂板,37℃生长过夜,挑单克隆菌培养,提取质粒,37℃酶切鉴定后,测序分析. 1.35-RACE-PCR 采用快速扩增cDNA末端(RapidamplificationofcDNAends,RACE)技术在获得基因片段的基础 上设计基因5-RACE基因特异性嵌套引物R1和R2,其序列分别为PRACE1(5’-TCCTGAGTGAAGTCGATAGCCA-3’),PRACE2(5’-TCCTCTGGTGTCTAACAAGGTGCGA-3’).用心脏组织mRNA反转录所得的cDNA文库为模板,嵌套PCR引物进行cDNA末端扩增.用琼脂糖凝胶电泳法回收扩增PCR产 物,用T载体连接,转化大肠杆菌DH5.转化后经酶切鉴定和进一步测序分析,最终获得其全长cDNA序列. 1.4Northern印迹膜的制备 用传统的酚Π氯仿抽提方法从15,18,20和23周的人类早期胚胎各组织以及妊娠34d和40d的总胚胎组织中提取总RNA.用DEPC抑制RNA的降解.每一电泳泳道取总RNA20μg进行1%甲醛变性凝胶电泳,使用20×SSC作为转移液,按常规方法转印尼龙膜,结合有RNA的尼龙膜经80℃烘烤2h,紫外灯照射15min. 1.5Northern杂交 利用随机引物标记试剂盒对探针进行[α232p]dCTP标记,将从CLONTECH公