补肾助孕方对LPD大鼠卵巢中VEGF蛋白表达影响.docVIP

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补肾助孕方对LPD大鼠卵巢中VEGF蛋白表达影响

补肾助孕方对LPD大鼠卵巢中VEGF蛋白表达影响【摘要】 目的 考察补肾助孕方对黄体功能不全性(LPD)不孕症大鼠卵巢组织中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法 采用Western-Blot检测补肾助孕方高、中、低剂量组与阳性药、空白对照、模型组大鼠卵巢组织中VEGF蛋白表达。结果 补肾助孕方各剂量组、阳性药组、空白组与模型组比较,VEGF蛋白表达的条带明显加深。结论 补肾助孕方增加LPD大鼠卵巢组织中VEGF蛋白表达,从而促进黄体毛细血管生成,确保黄体最佳发育,起到治疗黄体功能不全性不孕症的作用。? 【关键词】补肾助孕方;黄体功能不全;米非司酮片;血管内皮生长因子 补肾助孕方是全国名老中医妇科专家夏桂成的临床验方,由赤芍、山药、菟丝子、白芍等八味中药组成。LPD系指排卵后卵泡形成的黄体,这一与生殖密切相关的暂时的内分泌器官发育和功能不全。其临床特点是不孕和反复早期流产,约有3.5%~10%的不孕症、35%的早期妊娠流产和4%~60%的习惯性流产是由LPD所引起的[1]。 1 材料 1.1 实验动物 清洁级SD雌性大鼠90只(未孕,体质量200~240 g)和清洁级SD雄性大鼠45只(体质量250~280 g)。由南京中医药大学实验动物中心提供,使用动物合格证:SYXK(苏)2005-0009。 1.2 药品与试剂 补肾助孕方药购于南京中医药大学百草堂,采用传统水煎提取。米非司酮片(RU486),上海医药集团25 mg/片,生产日期:060702。达芙通,苏威制药生产,10 mg/片,批号:329301。考马斯亮蓝G250,北京鼎国生物技术有限责任公司,Lot No:DH077。BSA,南京布克生物技术有限公司分装,Lot No:0628S04。β-巯基乙醇,AMRESCO公司,Lot No:0892B25。PMSF,AMRESCO公司,Lot No:0754。预染蛋白Marker,北京鼎国生物技术有限责任公司,Lot No:B023-3。VEGF一抗,santa cruz公司,goat polyclonal lgG,Lot No:I2606。β-actin Monoclonal Ab,联科生物,Lot No:055k4854250707。兔抗羊lgG-HRP,联科生物,Lot No:71942。羊抗鼠lgG-HRP,联科生物,Lot No:73750。 1.3 实验仪器 核酸蛋白分析仪,美国BECKMAN公司,型号DU640。PH计,HANNA,型号HI 221。? 电泳仪,北京六一仪器厂,型号DYY-C。电泳槽,Bio-Rad。水平脱色摇床,南京大学南达生物技术开发公司,型号TY-80S。 2 方法与步骤 2.1 造模方法 以米非司酮(RU486)建立LPD不孕症模型[2-3]。雌鼠妊娠第3天各组(除空白对照组)灌服米非司酮溶液造成LPD不孕症模型,每天0.01 ml/g。 2.2 实验步骤 随机将雌鼠分为6组、每组15只,即:补肾助孕方低剂量组9.57 g(含生药量)/kg、中剂量组19.13 g(含生药量)/kg、高剂量组38.26 g(含生药量)/kg,阳性药(达芙通)组2 mg/kg,空白对照组和模型组给等体积生理盐水,每只雌鼠灌胃给药0.01 ml/g于第4天起连续灌胃给药10 d,第13天于20:30左右,将雌雄大鼠(2:1)比例合笼,次日于07:30左右雌鼠阴道涂片观察,以发现大量精子为妊娠第1天。于妊娠第3天各组雌鼠灌服米非司酮,期间各组雌鼠连续灌胃给药。于妊娠第5天大鼠处死,取0.1 g卵巢组织,置于0.4 ml蛋白裂解液(50 mM Tris,150 mM NaCl,1%Triton X-100,2 mM PMSF,pH 8.0)中匀浆,在冰上静置30 min后,4℃离心取上清液。用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白含量。取50 μg总蛋白上SDS蛋白电泳,采用10%分离胶,然后再经转移电泳将蛋白转移至PVDF膜上。再将PVDF进行相应的免疫反应、化学发光、显影,定影。 3 实验结果? 胶片扫描结果显示,模型组、阳性药组、空白组、补肾助孕方药物组(高、中、低三个剂量)卵巢组织中的内参β-actin蛋白条带粗细、深浅基本一致,蛋白表达量基本相同(图1)。而模型组与空白组比较,其卵巢中的VEGF蛋白表达明显减少,阳性药及补肾助孕方药物组与模型组比较,能显著促进大鼠卵巢中的VEGF蛋白表达。 4 讨论? 近10年,在妇产科生殖内分泌领域中VEGF受到了极大重视,己成为生殖医学研究的热点和前沿[4-5]。大量的研究表明,VEGF在雌性哺乳动物子宫和卵巢等性腺系统中有特异表达,并参与排卵、胚胎植入、胎盘发生等多种雌性生

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