南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修复酶基因和其修复DNA损伤分子机制研究.pdfVIP

摘 要 南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L 光修复酶基因及其修复DNA 损伤 分子机制研究 摘 要 光复活修复是生物体的一种重要的 DNA 损伤修复机制，对保持生物体遗 传信息的延续性、遗传结构的完整性有重要作用。所谓光复活修复，是指在 DNA 光修复酶（photolyase ）的作用下以光为驱动力来修复紫外线损伤的 DNA ，可见， 光修复酶是光复活修复作用最主要的功能物质。 南极冰藻是指生活在南极海冰、海冰边缘或海水等极端环境中的一大类微藻 的总称，是南极地区主要的初级生产者。南极冰藻长期在南极强紫外辐射环境中 生长和繁殖，光修复酶承担了修复其 DNA 损伤的重要功能。南极冰藻 DNA 光 修复酶对其紫外辐射损伤 DNA 的修复作用是南极衣藻抵抗紫外增强和适应南 极强紫外线辐射生境的关键生存机制，因此，从分子水平上研究南极冰藻的光复 活修复作用是非常有必要的。南极衣藻 Chlamydomonas sp. ICE-L 是一种真核单 胞藻，是南极冰藻类群中数量最多和最具有代表性的一种绿藻，对它的光修复酶 的研究可以为南极生境和其他物种的研究提供基础。 本论文主要进行了以下研究内容：普通 PCR 和 RACE 法克隆获得了南极 衣藻 Chlamydomonas sp. ICE-L 的光修复酶基因 PHR2 并对PHR2 基因进行了 生物信息学分析；应用实时定量 PCR 技术对南极冰藻 Chlamydomonas sp. ICE-L 光修复酶基因 PHR2 的转录调控机制进行了研究；为验证PHR2 光修复 酶的功能，构建了光修复酶基因PHR2 的原核表达载体并实现了在原核表达系统 BL21 （DE3 ）中的表达；通过单因素实验、Box-Behnkens 设计和响应面分析法 对 PHR2 蛋白的表达条件进行了优化，建立了影响因素的二次回归模型；利用 Ni-NTA 亲和层析对目的蛋白进行纯化，获得纯度较高的目的蛋白；利用 Edman 降解法对目的蛋白进行N 端测序；验证了 PHR2 光修复酶在表达菌株中的修复 活性和光修复酶的体外修复活性。 I 南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L 光修复酶基因及其修复DNA 紫外损伤分子机制研究 克隆得到南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L 光修复酶基因PHR2 cDNA 全 长为2651 bp ，编码579 个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为64.3 KDa，同源性 对比发现 PHR2 的氨基酸序说列与莱茵衣藻的 PHR2 的相似度为 68% ； qRT-PCR 结果显示，在强光和紫外胁迫条件下 PHR2 表达量升高，说明 PHR2 基因对强光和紫外胁迫时敏感的；SDS电泳分析表达的目的蛋白主要以可 溶性蛋白形式存在于细胞破碎液上清中，且分子量与预测分子量相同；响应面分 析法得到PHR2 蛋白最佳表达条件为pH 6.98 、NaCl 浓度为1.4%、IPTG 作用浓 度为0.53 mmol/L、诱导温度为22 °C，经验证，优化条件下目的蛋白的表达量与 理论预测值基本吻合；Ni-NTA 层析纯化后目的蛋白相对含量升高，杂蛋白含量 减少；N 端测序确认目的蛋白N 端到C 端序列依次为D/Q/T/A-P-K-R-T，与目 标序列基本相符，确认为 PHR2 光修复酶；活性分析试验证明 PHR2 光修复酶 体内外活性良好，可以有效的修复紫外辐射损伤。 关键词：南极冰藻，Chlamydomonas sp. ICE-L ，光修复酶，PHR2 基因，原核表 达，表达优化，活性分析 II