第6章_预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则.doc

预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则 一、前言??? DNA疫苗是将外源目的基因片段构建在DNA质粒中，重组后的DNA导入机体后可表达目的蛋白，目的蛋白刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防某种疾病的生物制剂。该指导原适用于以DNA质粒为载体的预防用制品。其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体的申报内容。其基本原则是：安全有效，质量可控，同时应鼓励创新，促进DNA疫苗的研究。对一些新的技术路线要建立相应的质控要求，可有一定的灵活性，应注意到DNA疫苗只是处于研究的初级阶段，而且与常规生物制品相比有其本身的特点，需要不断的积累经验。为此，申请者应加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制订标准操作规程及质控标准，并予严格实施。 ??? 二、DNA疫苗构建的基本要求??? （一）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果：??? 1．应了解所预防疾病的流行情况、疾病的危害程度等；包括国内及国外对该类疾病的预防和治疗手段。 ??? 2．应了解国内外同类产品研究和开发等情况，其中包括所用的DNA载体、目的基因片段、简单的生产工艺、临床前试验和临床试验的结果及进展，以及该类产品所面临的主要问题。 ??? 3．对研制该类DNA制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析。 ??? 4．应对该方案与国内外已批准的或正在进行的方案的不同之处、特点及其优越性等进行分析。凡属新的方案，应提供其优越性及安全性的依据。 ??? 5．利益风险比。根据该预防方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。 ??? （二）DNA载体及宿主菌??? 1．测定DNA载体的全长核苷酸序列，以及与已知人类基因的同源性比较和分析。 ??? 2．对DNA载体的控制元件和选择标记的序列与来源，如：真核启动子、增强子、终止序列、抗生素抗性标记等进行分析。建议避免使用抗青霉素或其它饽邗０房咕氐目剐员昙牵好使用无抗性标记的DNA载体，若需要抗性标记，则可使用抗卡那霉素或新霉素的抗性标记。 ??? 3．对DNA载体的安全性进行研究和分析，尤其对病毒性启动子、哺乳动物细胞或病毒终止子的安全性进行研究分析。若使用非常用性或特殊的控制元件，应提供其安全性、对基因产物表达的影响以及其利弊权衡等进行分析。 ??? 4．明确宿主菌的基因型、原型、细菌的来源以及制备克隆菌群的方法步骤和所用实验材料。 ??? （三）目的基因??? 1．明确目的基因来源的病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、基因型和亚型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。 ??? 2．对目的基因的序列、大小、来源以及表达产物的预计大小进行分析；明确目的基因选择的依据以及其表达蛋白在预防中的作用。 ??? 3．若对目的基因进行了修饰，应对其修饰后的基因序列以及修饰后基因与人类已知基因序列的同源性进行分析。若在表达的目的重组蛋白以外有其它氨基酸寡肽同时表达时，应对寡肽的作用和选择的依据进行分析。并对基因修饰或重组的利弊权衡进行分析。 ??? （四）重组质粒的构建过程??? 1．提供重组体质粒构建的详细步骤及每一步的鉴定及确证方法。 ??? 2．重组质粒库：构建完成后应建立重组质粒库，对重组质粒应进行全基因序列分析，尤其对DNA载体的控制元件和选择标记基因有无变异进行分析。对插入的目的基因序列进行分析，检查有无变异。 ??? 3．应当对重组质粒的转化、扩增及纯化条件进行优化。对重组质粒库中质粒的浓度、含量等进行分析。对重组质粒的保存条件以及稳定性进行研究。 ??? （五）表达产物的鉴定??? 1．将重组质粒转化合适的哺乳动物细胞，对转化条件进行优化。 ??? 2．建立对表达产物的分析方法，包括表达产物的大小、特征等。 ??? 3．建立对表达产物的免疫学反应的特征进行分析的方法。 ??? 三、DNA疫苗的生产工艺??? （一）建立菌种库：对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。对种子库的遗传稳定性进行分析，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库无噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括染色体组型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保