实验五食物中核黄素含量测定及相关应用方案.doc

实验五 食物中核黄素含量测定 （荧光法） （－）目的意义 核黄素是机体的物质代谢和能量代谢中不可缺少的物质。通过测定食物中核黄素含量，可了解人体核黄素摄入情况。 （二）原理 核黄素受到波长为440～500nm的光照射后能产生光黄素（luniflavin），此物质能产生较强的荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素浓度成正比。 试液中再加人低亚硫酸钠（Na2S2O4），将荧光素还原为无荧光物质。然后再测定试液中残余荧光物质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。 （三）仪器与试剂 1．荧光光度计 2．高压消毒锅 3．锥形烧瓶，核黄素吸附柱（如图6－1） 4. 1.0mol／L盐酸溶液 吸取分析纯浓盐酸83.3ml于1L容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。 5. 0.lmol／L盐酸溶液 将上液按1：10稀释。 6．4％氢氧化钠溶液，0.4％氢氧化钠溶液。 7．3％高锰酸钾溶液。 8．3％过氧化氢溶液。 9．核黄素储备液（23ug／ml） 精确称取已干燥过的核黄素（在干燥器中放置24h）25mg，加少量蒸馏水溶解后倒入1L容量瓶，加蒸馏水500ml，加入2.4ml冰醋酸，将其放在温水中摇动使颗粒完全溶解，冷却后稀释至刻度，加入少量甲苯，避光冷藏备用。 10. 核黄素工作液（0.lug／ml） 吸取上液1.0ml，加水稀释至250ml。避光，贮于4℃冰箱中可保存1周。 11．20％低亚硫酸钠溶液 用时现配，保存在冰水浴中，4h内有效。 12. 0.04％溴甲酚绿指示剂 称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4m1 0.4％氢氧化钠溶液研磨，加少许水继续研磨直至完全溶解，加水稀释至250ml。 13. 2.5mol／L无水乙酸钠溶液 使用时现配制。 14．10％木瓜蛋白酶溶液 使用前用2.5mol／L无水乙酸钠溶液配制。 15．10％淀粉酶溶液 使用前用2.5mol／L无水乙酸钠溶液配制。 16. 洗脱液 丙酮：冰酷酸：水（5：2：9）。 ? ? （四）操作步骤 整个操作过程需避光进行。 1．样品前处理 称取2～10g样品（约含10～200ug核黄素）于100ml锥形瓶中，加人50m1 0.1mol／L盐酸，搅拌使样品颗粒分散均匀后，置于高压锅内，在10.3×104Pa高压下水解样品30min。水解液冷却后，加人4％氢氧化钠调pH至4.5（取少许水解液用溴甲酚绿检验呈草绿色，pH即为4.5）。 2．酶解 （1）含有淀粉样品的水解液加入3ml 10％淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。 （2）含有高蛋白样品的水解液加人3ml 10％木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。 上述酶水解液用蒸馏水定容至100ml，过滤。滤液在4℃冰箱可保存1周。 3．氧化去杂质 取试管2支分别编号A和B，按表6－1操作。 ? 混匀后放置2min以氧化样品中的杂质与色素，再滴加3％过氧化氢至溶液褪色，以还原高锰酸钾。剧烈摇动试管，使多余氧气逸出。 4．核黄素的吸附与洗脱 吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，然后称取1g硅镁吸附剂湿法装柱（约5cm高）。勿使柱内产生气泡，调节流速为60滴／分钟左右。将A和B管内氧化后的液体通过吸附柱后，用约20ml热蒸馏水洗脱样品中的杂质，再用5.0ml洗脱液将核黄素洗脱，用具塞试管收集洗脱液，再用蒸馏水洗脱吸附柱，收集洗出的液体合并于具塞试管中，定容至10ml，混匀后留待测荧光强度。 5.测定荧光强度 选择激发波长为420nm，发射波长为520nm，测定样品管及标准管的荧光强度。然后，在各管的剩余液中加0.1m1 20％低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。 （五）结果计算 F—稀释倍数 W—样品重量，g S—标准管中核黄素含量；ug （六）结果说明 1. 加入低亚硫酸钠的量不能过多以免影响荧光强度，加入后必须立即读数，否则核黄素又会被空气氧化为荧光型。 2．过氧化氢不宜多加，因会产生气泡而影响比色。 3．如加入高锰酸钾后有氧化锰细微褐色溶液混浊，可离心使之澄清。 4. 不能用皂粉洗涤玻璃器材，应用硫酸—重铬酸钾洗液浸洗，再以清水洗净，继以蒸馏水冲洗。 ?