第三章番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的建立 - yzxzcom.DOC

第三章 番茄尖孢镰刀菌GFP体系的建立 自1973年Mishra和Tatum首次报道Neurospora crassa的DNA转化以来，许多丝状真菌已实现了DNA转化。目前，应用于丝状真菌转化的方法很多，最常用的转化方法是CaC12-PEG介导的原生质体转化。1978年，Hinnen等首先利用聚乙二醇作介质转化酵母原生质体获得成功[78]。周礼红等运用CaC12-PEG介导的转化方法成功将DNA片段转化进红曲霉，建立了红曲霉的遗传转化系统[79]。因此，高效的原生质体制备时转化的前提和基础[80,81,82]。其过程是将原生质体、外源载体DNA混合于一定浓度的 CaCl2、PEG缓冲溶液中进行融合转化。经原生质体再生后在选择性培养基上筛选转化子。的枯萎病菌的GFP转化体系。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株 分离自番茄植株的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FJAT-282，菌种保存于福建省农科院农业生物资源所菌种库内。 1.1.2 质粒 质粒pCT74，美国Oregon大学Ciuffetti博士惠赠。为强组成型表达的sGFP的载体，携真菌Pyrenophora tritici-repentis的ToxA启动子，同时带有潮霉素B（Hygromycin B）磷酸转移酶基因，已用于多种植物病原真菌转化（图3-1）。 图3-1 质粒pCT74图谱 Fig.3-1 map of plasmid pCT74 1.1.3 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉l5-20 g，定容至1000 mL；PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，定容至1000 mL；半固体再生培养基：马铃薯200 g，蔗糖 200 g，琼脂9 g，定容至1000 mL；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，琼脂15-20 g，定容至1000 mL，pH 7.0；LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，定容至1000 mL，pH 7.0；。 1.1.4 主要试剂及仪器 化学试剂：渗透压稳定剂选择山梨醇（sorbitol）、蔗糖（sucrose）、KCl或NaCl（STC：1.4 moL·L-1 sorbitol、10 mmoL·L-1 Tris-HCl，pH 7.5、50 mmoL·L-1 CaCl2）；0.8 moL·L-1 NaC1；PTC溶液 （40 % PEG、10 mmoL·L-1 Tris-HCl，pH 7.5、50 mmoL·L-1 CaCl2）。裂解酶：溶壁酶（Lywall Enzyme，购自广东省微生物研究所）崩溃酶（Drease，购自Sigma）。 仪器：摇床，恒温培养箱，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，冷冻离心机，打孔器，显微镜，荧光显微镜等。 1.2 方法 1.2.1 质粒DNA的提取（琼脂糖凝电泳） 将含质粒的菌种在LB固体培养基（含100 μg·mL-1 Amp）上，37 ℃培养12-24 h。用灭菌牙签挑取pCT74单菌落至LB液体培养基（含50 μg·mL-1 Amp）中，37 ℃，摇床培养至对数生长期。质粒DNA提取方法参照Plasmid Mini Kit（QIAGEN）试剂盒操作步骤，方法如下： ①收集3 mL菌悬液，4 ℃、6000 g离心15 min； ②弃上清，加入0.3 mL Buffer P1重悬菌体； ③加入0.3 mL Buffer P2剧烈震荡，室温静置5 min； ④加入0.3 mL Buffer P3剧烈震荡，冰浴5 min； ⑤4 ℃，13000 g 离心10 min； ⑥用1 mL Buffer QBT冲洗QIAGEN-TIP； ⑦将第五步的上清液通过QIAGEN-TIP； ⑧2 mL Buffer QC洗QIAGEN-TIP两次； ⑨收集用0.8 mL Buffer QF洗脱QIAGEN-TIP的液体； ⑩用0.56 mL室温下放置的异丙醇沉淀，4 ℃，13000 g离心30 min，用1 mL 70 %乙醇清洗，风干，ddH2O溶解，-20 ℃保存。 1.2.2 原生质体的制备 从PDA（含streptomycin sulphate）培养基上挑取少量菌丝于100/250 mL PDB三角瓶里摇瓶培养1-2 d。三层擦镜纸过滤除去菌丝，获得孢子悬浮液，调整浓度到1×107 cfu/mL 。吸1-2 mL孢子悬浮液至100/250 mL PDB培养基的三角瓶中，28 ℃，150 r·min-1摇床培养12-14 h。用三层灭菌滤纸过滤收集新鲜菌丝，用0.8 moL·L-1的NaCl充分洗涤。称取约600 mg新鲜菌丝体加 mL裂解液（20mg/mL Dre