目的基因的序列未知 - nq70com.PPT

关于“基因工程” 操作步骤的深入探讨 杭州市艮山中学 朱靖 两种酶也要有选择性，避免用同裂酶和同尾酶 * * 三、受体细胞的筛选 二、构建重组质粒时限制酶的选择 一、获取目的基因的方法 一、获取目的基因的方法 目的基因的序列已知： 用化学方法合成，或者用PCR扩增； 目的基因的序列未知： 建立基因文库，从基因文库中找到。 “基因文库相当于图书馆，目的基因就是图书。” 基因文库的构建 某生物体内全部DNA 限制酶 某生物体内全部DNA 限制酶 1.从基因文库中获取目的基因的一般过程： （1）依据已知的目的基因序列设计引物 （2）利用PCR技术从基因文库中扩增出目的基因 （3）进行凝胶电泳分离得到目的基因，并用试剂盒回收。 2.未知完整序列的目的基因获取过程： （5）对目的基因进行测序。 （1）将一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上，取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纤维滤膜吸印。 （2）制备有同位素标记的探针进行分子杂交。 （3）进行放射自显影后在培养皿上找出含有目的基因的菌落或噬菌斑。 （4）培养后，用反向PCR扩增出未知序列。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 DNA连接酶 反向PCR 3.序列完全未知的目的基因获取过程： （1）从其相近的物种中寻找出已经测序的该基因的相似基因，通过电脑软件比对出该基因可能存在的保守区域。 （2）针对基因的保守区设计简并引物，通过PCR从基因文库中扩增出目的基因的保守区。 （3）对保守区进行测序。 （4）用反向PCR扩增保守区以外的未知序列的片段。 （5）对目的基因测序。 实际操作中获取目的基因的方法 目的基因的序列已知： 用化学方法合成，或者用PCR扩增； 目的基因的序列未知： 通过测序使之成为已知序列。 二、构建重组质粒时限制酶的选择 完全同裂酶 识别位点和切点完全相同。 如BamH I和Bst I。 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 同尾酶 BamH I Bst I Hind Ⅲ BamH I Bst I 目的基因 EcoR I Pst I BamH I 目的基因 EcoR I PCR技术给目的基因添加限制酶切点： PCR EcoR I Pst I EcoR I Pst I “由于质粒上有抗生素如四环素的抗性基因，所以含有这种重组质粒的受体细胞就能够在有四环素的培养基中生长，而没有接纳重组DNA分子的细胞则不能在这种培养基上生长。这样就筛选到含有重组DNA分子的受体细胞。” 三、受体细胞的筛选 非目的转化子 目的转化子 非转化子 Ampr Tetr ROP ROI Sal I BamH I Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I pBR322 4363 bp ori 1.双抗生素抗性筛选 外源基因?BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因?Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡 2.Amp抗性和lacZ的?肽互补(蓝白斑)相结合 a b X-gal （无色） 多克隆位点 pUC18 2686 bp Amp r lacZ ori 5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） + 半乳糖 蓝白斑筛选原理：适用于含有?-半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等 ?-半乳糖苷酶 IPTG诱导 含Amp、X-gal、IPTG的培养基 非转化子 目的转化子 白色菌落 非目的转化子 lacZ+ Ampr 蓝色菌落 无Amp抗性，无菌斑生长 Ampr lacZ- 3.PCR检测法 ——鉴定阳性克隆最简单的方法 （1）利用抗生素抗性筛选出转化子。 （2）挑取转化子的单菌落进行培养、提取质粒。 （3）用限制酶切割质粒，对目的基因进行PCR扩增。 （4）进行琼脂糖凝胶电泳，然后将电泳标本置于凝胶成像系统中观察。 基因工程中筛选重组子的方法： 抗生素筛选 遗传表型筛选 α互补筛选（蓝白斑筛选） 限制酶分析筛选 基因探针筛选（原位杂交法） PCR筛选 DNA电泳检测法 …… 将某生物总DNA经过酶解，得到含有不同基因的许多DNA片段。将这些片段分别与运载体连接，然后导入细菌群体中，或体外包装到噬菌体颗粒上，各个受体菌或噬菌体分别含有这种生物的不同基因，便构成了该生物的基因文库。 载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息（lacZ’基因）。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后，它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac+ 细菌在呈色底物X-gal和诱导剂IPTG存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒编码区的多克隆位