CTAB法提取植物叶片RNA.docVIP

CTAB法提取白桦RNA方法 实验原理：LiCl最终浓度为2 mol/L 0.8 mol/L直接沉淀大分子RNA（包括rRNA和mRNA）需要注意的是Li离子对反转录酶有抑制作用，而Cl离子能抑制蛋白质合成的起始步骤，所以在mRNA反转录和体外翻译实验前不要使用LiCl沉淀DNA和RNA NaAc最终浓度为0.3mol/L（Ph5.0） ①所用所有试剂： Tris- CTAB：与RNA结合 β-巯基乙醇：防止被氧化 Tris饱和酚、氯仿：去蛋白质 5L LiCl、无水乙醇、70%乙醇、3 mol/L NaAc：使RNA沉淀 1×TAE、 BW：配制凝胶 Gol-rad或gold-view和6×loading buffer :前沿指示剂 ddH2O ②所有材料 用具 试剂瓶 、250烧杯 玻璃棒 250容量瓶 记号笔 天平 一次性手套 钥匙、 液氮 研钵、冰、线手套、枪、枪头、高压锅、电泳照相系统 离心机 、混摇机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽 ③实验准备： 1、CTAB 5g 直接加入试剂瓶（防止起泡） 2、NaCl 20.44g + 0.5M EDTA 12.5ml 用ddH2O 定容至225ml 3、空瓶贴标签加适量（100或50ml）的ddH2O LiCl NaAc 70%乙醇 氯仿 ddH2O 4、6个瓶 + 0.1%DEPC 在通风橱里戴双层手套，充分摇匀，气泡不很快消失 5、37度保温过夜 注意事项： 试剂瓶用洗洁精水浸泡一个小时，然后清水冲到不起泡，壁上不挂水珠，再用ddH2O冲两次，量筒等量器清洗后都用ddH2O冲洗两次 Tris 不可用0.1%DEPC处理，等其他组分处理完再加到CTAB中 所有瓶子用0.1%DEPC处理，除了β-巯基乙醇，Tris饱和酚（购买时小瓶装，直接用即可） 所有水溶试剂用ddH2O配置 加样器100-1000规格的，小于100则不准确 ④灭菌 1、将25ml Tris-HCl加入CTAB中， 2、瓶留一个缝，灭菌锅的桶中加适量水 3、枪头一层袋，离心管两层袋 4、共八个瓶 5、时间大概为一个半到两个小时 ⑤实验前准备 小研钵，杵，小钥匙中倒适量酒精，点燃，自灭后凉透（大概得30min）。 准备：液氮、材料（负40度）、垫纸（研钵下用）、手套（里外一层一次性手套，中间线手套）、冰（252）、恒温机（65度）、桌上多放一只一次性手套（放钥匙和杵）、将叶片放在手可触的地方 开始实验 3-5倍体积（650ul Tris-CTAB提取缓冲液，50ulβ-巯基乙醇）的65度预热的提取缓冲液，混匀 根据实验需要，取每管0.1-0.5g叶片置液氮中冷冻，研磨成粉末。首先将研钵、杵和钥匙充分冷冻（浇3-4次），加入叶片，加液氮，不超过五次。液氮多的时候轻磨，快没时用劲快磨，至白色为止。 粉末加入准备好的离心管中，大概2匙柄，充分混匀，放在65度恒温浴中15min，每隔2-3min摇一次，研钵和杵放水下冲，氯仿瓶放在冰中。 加入一倍体积（700ul）的氯仿，用混摇机摇匀，12000rpm,离心10min,取上清。 在冰中准备好离心管和氯仿，重复两次。 准备好500+60ul 5mol/L LiCl，200+150 ul冷无水乙醇，60ul 3 mol/L NaAc， 加入430ul上清液，静置15-30min，沉淀RNA 12000 rpm离心10min，注意放的方向，抽去上清，RNA沉淀为无色胶体状 用70%乙醇漂洗两次，切忌快速抽打，开口在通风橱里风干（大概15min），再加入20ul的ddH2O，反复抽打混匀，置于冰中备用。 电泳检测 多准备一只一次性手套，带小枪 配胶，1×TAE20 ml(稍多一点)、BW 0.8-1.0% g/ml（0.2g）于小锥形瓶中，轻摇（防止气泡）加热完全融化，待降到60度（手摸不烫）时加6-10ul gold-view即可，倒在插好梳子的胶盒中，待凝（大概15min） 电泳 恒压 60V左右（66） 或横流 45mA左右 30min 负极跑向正极 将电泳盒放入电泳槽中，加1×TAE没过胶面，将样品(1-4ul)和6×Loading buffer(2 ul)在一次性手套上混匀加入到胶孔中，盖好盖电泳。 将胶盒拿出到252，把胶放到检测室中检测照相。 样品保存 -40摄氏度或与无水乙醇以3：1充分混合后-40摄氏度保存 注：1、或者前沿指示剂只用gol-rad最后只与样品混匀即可 2、70%乙醇配置无水酒精按纯酒精即可。 3、整个实验过程禁止说话，即在没有条件的情况下，尽量创造一个无RNA酶的环境 4、实验提取过程尽量缩短时间,尽可能放在冰上 5、RNA沉淀为无色胶体状，白色明显沉淀是蛋白质