试验训项目五血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳2学时教学目标一.DOC

实验（训）项目五 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳（2学时） [教学目标] (一) 知识目标 1. 掌握血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理； 2. 熟悉电泳法分离血浆脂蛋白的意义； 3. 了解电泳法分离血浆脂蛋白的方法。 (二) 能力目标 1. 能够能在规定时间内正确完成电泳法分离血清脂蛋白的各项操作，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。 2. 能够通过血清脂蛋电泳结果鉴别高脂蛋白血症的分型。 3. 能够鉴定血清脂蛋电泳结果的异常状态，并能说明其临床意义。 [教学内容] 一、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理 二、血浆琼脂糖凝胶电泳 三、血浆脂蛋白成分检测的临床意义 实验 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 【实验目的】 1.了解电泳带中脂蛋白显色特点。 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。 3.掌握正常人血清脂蛋白的分类。 【实验原理】 琼脂糖是经过挑选、以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物，为一种含硫酸根、带负电荷的多糖类物质，具有离子交换性质，这种性质对电泳及凝胶过滤具有不良影响。琼脂是直链多糖，它由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基交替排列组成。 琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时，因为凝胶中含水量大（98～99%），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。 琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清用滤纸插条法（或其它方法）置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。 分析天平 1．预染血清 用加样器取血清0.2ml于0.5ml离心管内，加苏丹黑染色液0.02ml，混合后，置37℃水浴中30分钟，取出管心管，离心（2000转/分）5分钟，以去除多余的染料颗粒。 2．制备琼脂糖凝胶板 用天平称取相应质量的琼脂糖，配置0.45%的琼脂糖凝胶液。于沸水浴中加热融化，稍加冷却，均匀浇注在载玻片上，静置待其凝固。待琼脂糖凝胶凝固后，距一端2cm处，用宽约15mm的硬滤纸条（或宽铁片）垂直切入凝胶板，立即取出，打一小槽(1cm×01cm)，注意勿将小槽挑破。 3．加样 用加样器取经预染过的血清（约15~20μl），注入凝胶板上的小槽内。 4．电泳 将加完样的凝胶板平放在电泳槽中，样品端放于阴极一端。用两块四层厚滤纸（或纱布）于巴比妥缓冲液中浸湿，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端，敷于胶板两端各1cm左右“引桥”120V～130V3～4mA35～50min 5．保存 如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。若无干胶机，可用玻璃纸包好凝胶板（连同载玻片），其上平铺多层吸水滤纸，滤纸上再压上书等重物，吸干凝胶中的水分。也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但应随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度，以避免凝胶在脱水过程中龟裂。 【实验结果与分析】 绘出脂蛋白电泳图谱自阴极端起，原点为乳糜微粒（CM），依次为β脂蛋白、前β脂蛋白、α脂蛋白，正常可出现三条区带。判断结果的方法有： 直观可用肉眼直接观察，以各区带颜色深浅、宽窄加以描述 2．定量分析 ⑴切割分光光度法将凝胶板上的各脂蛋白区带分别用刀片切下来，置于盛有3ml蒸馏水的小试管中，另在空白区切下一块与脂蛋白区带大小相当的空白凝胶作为空白。各管置于沸水浴3 min，使琼脂糖凝胶溶解。待冷却后，以空白管调零，于波长660nm处比色，记录各管吸光度值。以α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。扫描定量预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白的各自含量 1. 预染血清与温度有关，低温着色慢，高温着色快，37℃较为适宜。 2. 浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。 3. 将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。 4. 制备干胶时，要严控制脱水的温度和速度，避免脱水时温度过高、速度太快引起凝胶收缩龟裂。 5．琼脂糖凝胶的浓度为％0.5％为宜，如果大于1％，β脂蛋白和