垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性影响实验的研究.pdf

中文摘要 垂体瘤转化基因 RNA 干扰对胶质瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性影响的实验研究 垂体瘤转化基因 RNA 干扰对胶质瘤细胞增殖、 凋亡及化疗敏感性影响的实验研究 中文摘要 目的：明确垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene ，PTTG ）的表达 与胶质瘤临床病理级别和患者预后的相关性。构建 PTTG RNA 干扰载体，观察 PTTG RNA 干扰对细胞增殖、凋亡及对化疗敏感性的影响。 方法：选择 80 例胶质瘤手术标本，按 WHO 胶质瘤分级标准，包括Ⅰ级 16 例、 Ⅱ级22 例，Ⅲ级 26 例、Ⅳ级 16 例，患者生存时间12 月 22 例，12-36 月 41 例，36 月 17 例，复发时间12 月 18 例，12- 36 月 39 例，36 月 23 例。免疫组化检测 PTTG 表达，测定其积分光密度值（IOD ）。 根据 PTTG 基因 cDNA 序列，设计针对 PTTG 基因的 3 组干扰序列，并设计 1 组阴性对照序列，克隆到真核表达载体 pGenesil-1 中，进行酶切鉴定和测序鉴定。将 构建好的 4 组重组质粒分别命名为 PTTG-1 组，PTTG-2 组，PTTG-3 组、阴性对照 NC(negative control)组。利用 RNA 干扰技术，将以上 shRNA 分别转染细胞中,逆转录 聚合酶链式反应（RT-PCR ）检测 PTTGmRNA 表达水平、Western Blot 检测 PTTG 蛋 白表达水平。 选取干扰效果最强的 shRNA 片段转染 U251 细胞，另用替莫唑胺（temozolomide ， TMZ ）作用于转染shRNA 片段的 U251 细胞， 四甲基偶氮唑盐（methyl thazoy terazolium, MTT ）比色法检测细胞生长状况，流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果：免疫组化结果显示 80 例胶质瘤标本中，其 IOD 值Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别 为 0.69±0.06、0.76±0.08、1.32±0.12、1.67±0.15， 随着肿瘤级别的增高而升高，各组 间比较差异有统计学意义(P0.05 或 0.01) 。患者复发时间越长，PTTG 蛋白表达越低， 复发时间越短，PTTG 蛋白表达越高，其 IOD 在复发时间12 月组、12-36 月组、36 月组分别为 1.60±0.20、0.98±0.10、0.61±0.08，各组间比较差异有统计学意义（P0.01 ）。 PTTG 蛋白表达与生存时间的关系显示患者生存时间越长，PTTG 蛋白表达越低，生 存时间越短，PTTG 蛋白表达越高，其 IOD 在生存时间12 月组、12-36 月组、36 月组分别为 1.55±0.14、1.01±0.13、0.65±0.08，各组间比较差异有统计学意义（P0.01 ）。 构建的 PTTG RNA 干扰序列和阴性对照序列经酶切和基因测序证明插入序列正 II 确，说明 PTTG RNA 干扰真核表达质粒和阴性对照表达质粒构建成功。 细胞在转染 PTTG 干扰载体后，提取细胞的总 RNA ，经 RT-PCR 电泳发现，在 转染24h 后，PTTG-2 、PTTG-3 即显示出抑制作用，PTTGmRNA 表达水平降低，PTTG-1 组对目的基因的抑制作用不明显；在转染 48h 后，各组均显示出抑制作用，但 PTTG -3 的抑制作用更明显；转染 72h 后，PTTG-1 组有微弱的抑制作用，PTTG -2 及 PTTG -3 组仍有显示明显的抑制作用，但 PTTG -3 抑制作用较 PTTG -2 更强烈。 Western blot 检测不同时间 PTTG 蛋白的变化显示，在转染 24h 后，PTTG-1 、 PTTG-2 、PTTG -3 组对目的基因的抑制作用均不明显；在转染 48h 后，PTTG-1 、 PTTG-2 、PTTG-3 组均显示出抑制作用，但 PTTG-3 的抑制作用更明显；转染72h 小 时后，PTTG-1 组没有抑制作用，PTTG-2 及 PTTG