影响猪体细胞克隆胚胎发育能力因素的研究.pdfVIP

摘要 体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力，已 成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪在几个国家已经取得成功，但是其克隆 效率很低(1％)。本研究以建立高效的猪体细胞核移植体系为目的．系统研究了影响核移植效率 的因素，通过优化技术，改善培养条件，达到稳定大量地生产克隆胚胎，并进行胚胎移植以期获 得克隆猪的出生。 本研究首先建立了中国实验用小型猪(香猪)的胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒 细胞三种细胞系，并对胎儿成纤维细胞系的染色体倍性及其对细胞周期同期化处理的反应进行了 研究。染色体倍性检测表明．在传代10次之前，胎儿成纤维细胞染色体数日正常倍性率在90％ 以上。比较了血清饥饿和接触抑制诱导胎儿成纤维细胞进入GdGl期的效率，发现二者差异不显 伊0．05)。 以香猪胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞和颗粒细胞三种细胞为核供体进行核移植。对供体 细胞血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等影响克隆效率的供体因素研究表明：血清 饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；选择圆形光滑的细胞有利于提高融合率；不 同个体不同类型的供体细胞对克隆的效率有一定的影响。 尝试性地以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟猪卵母细胞构建克隆胚 胎，得到了转GFP的囊胚，囊胚率在5．9～12．5％。与非转基因细胞相比，转GFP细胞为核供体对 囊胚率的形成无明显影响。 在卵母细胞成熟上首次尝试使用了一种新的培养基PzM，尽管成熟率不高，但成熟的卵母细 胞的孤雌发育能力与常规成熟培养基NCSU-23相比无差异，两种培养基仍以NCSU．23成熟为好。 NCSU-23、PZM两种培养基在低氧下成熟培养卵母细胞时，不能提高孤雌胚发育能力。在高低氧 浓度(7％02和20％02)下培养孤雌胚胎，低氧(7％02)条件下提高了囊胚率和囊胚的细胞数， 其中PZM-3能显著提高囊胚细胞数(Po．05)。 通过卵母细胞的体外成熟和孤雌激活的大量实验，优化了卵母细胞成熟和孤雌发育的方案： 抽吸卵巢上3-4mm的卵泡，挑选A级卵丘细胞一卵母细胞复合体(COCs)培养，成熟培养后严格 挑选卵黄膜完整、胞质均匀，卵周隙清楚、排出第一极体的成熟卵母细胞进行激活，培养在7％ 02的气相下PZM-3培养基中，胚胎密度为每微升培养液2个胚胎，可显著提高孤雌胚胎的囊胚 率和囊胚细胞数。 在核移植方案上，探索了卵龄和激活方案对猪体细胞核移植效率的影响，认为卵母细胞成熟 时间42h时盲吸去核和低钙(0．1mM ca2+)一次融合激活是本实验的优化方案。 在优化了以上各个环节的基础上，改进了克隆胚胎培养系统。本研究首次利用低氧条件(7％ 02)下培养成熟的猪卵母细胞为受体，进行体细胞核移植。与高氧(20％02)的气相条件相比， 克隆胚胎的囊胚率和囊胚细胞数得到了显著提高(Po．05)。在克隆胚的体外培养方面，系统地 vs 比较了低、高氧浓度(7％02 响，结果表明在低氧条件下提高了胚胎的囊胚率和囊胚细胞数，三种培养基间差异不显著(P 2,5％vs8．2±1．2％；46．3±9．6vs31．0±2．1)，而PZM．3在低氧下只能显著提高囊胚的细胞数(P EGF O．05)，对囊胚率无显著影响。此外在胚胎发育的2-4细胞阶段。培养基NCSU．23添加10ng／ml 能显著提高(P0．05)来自初情期前卵巢卵母细胞的克隆胚的囊胚率。 为了检测体外生产的胚胎质量，对克隆囊胚的结构组成做了差异染色，结果表明克隆囊胚的 结构正常，内细胞团细胞数与总细胞数的比率都在20％以上，平均比率为38．6％。在以上实验基 础上，早期胚胎(1-4细胞胚胎)进行了手术法胚胎移植，以期获得克隆猪的出生。移植受体母 猪12头，第一批预试验9头有4头受体母猪超过两个情期(45天)才返情。第二批克隆胚移植 受体母猪2头，32天B超检测有l头妊娠，妊娠率为50％；移植克隆胚同时配种的受体母猪1 头，32天B超检测妊娠。52天检测两头妊娠受体母猪妊娠正常。 关键词：猪卵母细胞体外成熟核移植氧浓度细胞数 lI Abstract Cloned somati