同步检测7 种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR (Arm - 渔业科学进展.PDFVIP

第37 卷 第4 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.37, No.4 2 0 1 6 年 8 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Aug., 2016 DOI: 10.11758/yykxjz.20150606001 / 同步检测7 种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR (Arm-PCR)方法的建立和应用* 1,3 1 1,2① 1 1,3 王胜强 耿伟光 史成银 李 晋 粟子丹 ( 1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071 ； 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071 ； 3. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306) 摘要 淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、 传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染 性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原，危害巨大。为实现这7 种病原的高通量、同步 检测，本研究在分析这7 种病毒基因序列的基础上，设计了9 组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR) 引物， 并对扩增体系中的Taq 酶、Mg2+ 、dNTP、Primer Mix 浓度及退火温度等参数进行调整和优化，结合基 因芯片检测技术，建立了同步检测7 种鱼类病毒的Arm-PCR 方法。优化后的Arm-PCR 方法第一步PCR 体系为：Taq 酶(2.5 U/μl) 1.0 μl ，10×PCR Buffer(含20 mmol/L 的Mg2+) 5 μl ，dNTP(各2.5 mmol/L) 5 μl ， 10×Primer Mix(各2 μmol/L) 9 μl ，模板1 μl ，ddH2O 补足至50 μl ，退火温度为56℃。研究结果显示，该 方法可以在1 支反应管内对上述7 种病毒的9 个致病基因同步进行扩增和检测，检测灵敏度分别为 101 2 3 copies/μl (RGNNV、VHSV 、ISAV-NS、ISAV-MA)、10 copies/μl (LCDV、Mega 、IHNV、IPNV)和10 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒，TRBIV)。该方法特异性强，与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA 不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7 种鱼类病毒的Arm-PCR 方法具有高通量、高灵敏度、高 准确性的优势，能有效提高工作效率，在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。 关键词 鱼类病毒；多重检测；高通量；多重PCR 中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2016)04-0128-07 随着社会经济的快速发展，水产养殖业也呈现出 病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV) (Wallace 养殖规模和养殖技术的空前提高，尤其在集约化养殖 et al, 2008)、病毒性出血败血症病毒(Viral hemorrhagic 和工厂化养殖方面发展迅速。但在海水经济鱼类的养 septicemia virus, VHSV) (Isshiki et al, 2001)和传染性鲑 殖过程中，病毒性疾病的暴发往往会给养殖业带来巨