改造后的抗菌肽AD 基因在毕赤酵母中表达效价研究3.PDF

中　国　生 　物 　工 　程 　杂 　志 第 23 卷第 8 期 CHINA BIOTECHNOLOGY 2003 年 8 月 改造后的抗菌肽 AD 基因在毕赤酵母中 表达效价研究 1 1 1 1 2 2 赵亚华 　徐 　伟 　蔡家伟 　胡 　康 　廖富　 　黄 自然 ( 1 华南农业大学生命科学学院　广州 　510642 　　2 华南农业大学艺术设计学院　广州 　510642) 摘要 　通过 PCR 方法使抗菌肽AD 基因中带有 X ho Ⅰ和 X ba Ⅰ酶切位点序列 ,再克隆到表达载体 α p PICZ A 中 ,重组表达载体转化 GS115 ,经重组酵母菌表达的抗菌肽 AD ,其 N 端去除了其它氨基 酸 。对重组抗菌肽培养条件进行优化 ,在 YEPD 中含葡萄糖 2 % ,p H 为 75 ,重组酵母菌培养 30h 后 ,05 % 甲醇诱导42h ,杀菌效价达 1843 ,是改造前的31 倍 。最后重组抗菌肽经 CMcellulose 23 柱层析得到纯化 。 α 关键词 　抗菌肽 AD 　表达载体 p PICZ A GS115 　表达效价 　　青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而 用 。针对黄亚东改造的Cecropin AD ,发现其经酵母 引发的各类疾病不再束手无策 ,并由此发展了大量 表达后的目的抗菌肽 N 端比预期序列多 3 个氨基 β 的 内酰胺类抗生素 ,对保护人类健康作出了巨大 酸 ,分别是 Glu 、Phe 、Met , 前两个为酶切点 EcoR Ⅰ 贡献 。但随着上述青霉素类抗生素的广泛使用 ,不 的 GAATTC 编码 , 后一个为 ATG 编码 。它们可能 断产生出诸多新问题 。如β 内酰胺类抗生素的过 会降低 Cecropin AD 的效价 。本实验针对多出的三 敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生 。同时 , 个氨基酸 ,通过设计 PCR 引物 ,改变克隆的酶切位 大部分抗生素只具杀菌作用对细菌产生的毒素成 点 ,使最终经毕赤酵母表达后的抗菌肽不含这三个 分完全无中和作用 ,很多抗生素还能使炎症加重 , 氨基酸 , 以提高 Cecropin AD 的杀菌效价 。 于是人们开始寻找新一代抗菌剂[ 1] 。 1 　材料 抗菌肽是生物体内诱导产生的一种具有强抗 菌作用的多肽类物质 ,分子量为 4000Da 左右 , 由30 11 　菌种及质粒 α 多个氨基酸组成 ,它的两亲性 螺旋结构可使细胞 E . coli K D 、E . coli TOP10 、酵 母 受 体 菌 12 31 膜形成通道 ,破坏膜势 ,使细胞内物质外渗 ,导致细 GS115 及质粒 p HILS1CAD5 ( 含有抗菌肽 AD 基 胞死亡 ,起到杀菌作用[2 ] 。同时具有青霉素类抗生 ) α 因 、p PICZ A 均由黄 自然教授提供 。 素无法比拟的优越性 :不会诱导抗药菌株的产生 ,