组织文化7-9章.doc

第七章 细胞培养 植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlandt：观点：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞 首次进行离体细胞培养 小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞 《关于单离植物细胞培养实验》我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。 意义1. 建立单细胞无性系。2. 对培养的单细胞进行人工诱发突变。3. 排除体细胞干扰。4. 遗传转化受体的建立 一、单细胞的分离 1、由完整的植物器官分离单细胞 （1）机械法 方法：用解剖刀刮取。 研碎，过滤和离心 特点：细胞不受酶的伤害 无须质壁分离 （2）酶解法 方法：果胶酶等 特点：可获得单纯的材料 2. 由培养组织中分离单细胞 愈伤组织——游离细胞 悬浮培养物 二、悬浮培养 1.培养类型2.悬浮培养条件3.细胞生长的计量 4.细胞活力的测定 （一）细胞培养过程：1. 择适宜的外植体；2. 诱导疏松愈伤组织；3. 选择适宜的培养基；4. 悬浮培养；5. 悬浮细胞的继代与选择；6. 悬浮细胞的同步化；7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。 （二）优良悬浮培养体系要求：A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更短时间便可增加一倍。 三、细胞培养的特性： 1. 植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差； 2. 细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素； 3. 细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350 um一400 um 的团块，悬浮培养较困难； 4. 培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应 5. 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。 悬浮培养 指将游离的植物细胞，按照一定的细胞密度，悬浮在液体中进行培养的一种方式。培养目的 建立单细胞培养物 1.培养类型 （1）分批培养 指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。 特点： 除气体和挥发性代谢物外，其它都是密闭的 细胞生长呈S形曲线 需要不断继代 连续培养 利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的方式。特点：培养基的容积恒定。为封闭型和开放型 ① 封闭型 排除的旧培养基由加入的新培养基补充。特点：进出数量保持平衡 胞数目不断增加 ② 开放型 注入的新鲜培养液的容积与流出的原有培养液及其中的细胞的相等 特点：细胞数量相等。。。。长速度保持在高的恒定水平。分为化学恒定式和浊度恒定式 2.悬浮培养条件 （1）培养基 基本培养基 B5和ER培养基，磷酸盐 激素 生长快、易散碎的愈伤组织 （2）培养物的振荡 旋转式摇床 转床 （3）培养细胞的同步化 培养中的大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。方法: 饥饿法 停止供应所需的营养成分等 抑制法: 加入DNA合成抑制剂 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。 3.细胞生长的计量 （1）细胞计数（2）细胞进密实体积（3）细胞鲜重（4）细胞干重 4.细胞活力的测定 （1）相差显微术法（2）四唑盐还原法TTC（3）二乙酸荧光素法FDA（4）伊凡蓝染色法 四、单细胞培养 1.单细胞培养方法 1）平板培养法 将悬浮液接种在薄层固体培养基上的方式 点：便于在显微镜下连续观察 （2）微室培养 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基的方法。特点： 能观察细胞团形成的全过程 细胞只能短期分裂 （3）看护培养 用一块愈伤组织（或花药）来看护细胞的培养方法。特点： 方法简便 不便观察细胞的分裂和细胞团的形成 2.单细胞培养程序 （1）建立细胞株（2）高产细胞株的选择（3）分化培养和扩大培养（4）鉴定和提取 （1）建立细胞株 细胞株：来自一个单细胞的细胞团。① 材料选取 选择易于分散的花粉 选择分散性好的愈伤组织 质地坚实 愈伤组织 疏松易碎 从叶肉、根尖、髓