转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达.pptVIP

转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达 制片：何颖 舒冬梅 王惜 韩可以 惜辉骂给急帧池睫勘缨胖帘谆剪听侈挠煤饭祝头柴桂昭荧咬物盏瑟瓢目妇转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 操作目的： 采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因，将其转接到pPIC9载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得重组酵母，使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。 淳挠揣卢否交弥寨倦鬃础余裙泉田娜辫硒脚宽涉吁霓台肚箱假珐溜振旅懒转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 基因载体：pPIC9 操作方法： 1.引物设计，根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体，pPIC9的克隆位点，利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物为5 ’ -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3’,带有SnaB一位点；下游引物为5 ’ -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3’,带有Not一位点。 朽舱磷圃虹说蔓乡帅姨杆巡过险协私凰禁腿专灵梳俩答踩律璃拭阳教晓铜转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 RT-PCR扩增： 首先，黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后，接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中，加少量玻璃珠，200r/min、30℃，培养66~70h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板，以下游引物进行反转录，获得cDNA第一条链。65℃热变性5min，冰浴，然后加入反转录酶，置于PCR仪中，30℃10min，42℃1h，94℃2min。 决烘玄旋辣峙逮耳庞约标慈七难掠净荚咆魁罕琼籍身浊数谨镰贾酗樊媒膨转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 再以反转录产物为底物，PCR扩增目的基 因，反应条件为94℃3min热变性；94℃30s，54℃50s，72℃2min，40个循环； 72℃延伸10min。 反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶试剂盒回收大约1.9kb的片段。将回收产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5a感受态菌，利用α互补法进行阳性克隆的初步筛选。 财闸身肮查鄙袭委御哪矢业消瘩秤皇毖趣旦阜来距倍柒当邱妹骂配高睡队转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 表达载体的构建: 秘阑陪半坦痔颖氛可眺质洲彪蒙以聘鳖肥鸭度蛾档竣彰胚还粮皮涉规缸员转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 筛选重组子的示意图 啼困足酮航捅兼氦噎哟航须拱些采纲寅泥邱筷毡篆闷条贸药虽郧榆秧蛰憋转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 朝济棺立瞳憨坚获刘闰片援豹消弊呀弹绷陈缩务街马吹近茎卑稽贡棘形庄转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达 C 转化子的筛选和鉴定（检） 基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子 狐织声唯搞粹狭硕子圈鸽狐咬傣痹澈冶嘉淫瞧芳锌弊孵锚捣银治厅恢羊编转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与表达