半巢式PCR 法构建天然噬菌体单域重链.pdfVIP

※生物工程 食品科学 2010, Vol. 31, No. 19 299 半巢式PCR 法构建天然噬菌体单域重链 抗体文库 1,2 1,2 , 1,2 2 涂 追 ，许 杨 * ，何庆华 ，陶 勇 ( 1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047 ；2 .南昌大学 中德联合研究院，江西南昌 330047) 摘 要：目的：构建天然噬菌体单域重链抗体文库，淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法：以未 经免疫的健康羊驼(L ama p acos)外周血为起始材料，提取RNA 反转录为cDNA ，根据重链抗体保守序列设计引物， 通过半巢式PCR 法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因，将其克隆至噬菌粒pHEN 1，电转化大肠杆菌TG 1 得到 初级抗体库，辅助噬菌体KM 13 感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3 种人工抗原进行淘选。结果： 单域重链抗体编码基因得到有效扩增，经10 次电转化获得初级文库，命名为SNAL ，实际库容量达到1.6 ×107 个 独立克隆，菌落P CR 鉴定结果表明，克隆效率约为87 % ，辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SN A -P D L ， 滴度达10 13 CFU/mL 。对3 种不同人工抗原DON -MB SA 、N OR -B SA 和AFB 1-OVA 的淘选均有富集现象。结论： 构建了天然噬菌体单域重链抗体文库，文库的多样性较好，可以用于后续淘选。 关键词：单域重链抗体；V H H 抗体；噬菌体文库；羊驼；半抗原 Construction of Alpaca-derived Naive Single-domain Antibody Phage Display Library by Semi-nested PCR TU Zhu i1,2 ，XU Y an g1,2, * ，HE Qing-hu a1,2 ，TA O Y on g2 (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology , Nanchang University, Nanchang 330047, China ； 2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China) Abstract ：Obj ective: To construct a single-domain heavy chain antibody phage display library for food safety detection . Methods: Total RNA was purified from peripheral lymphocytes of two healthy non-immune alpaca (Lama p acos) and directly used for complementary DNA (cDNA) synthesis. The repertoire of VHH encoding DNAs was amplified by semi-nested PCR, and the PCR products were cloned into the phagemid vector pHEN 1. Through the electroporation of E. coli TG 1, a primary library was established and then rescued by the helper phage KM 13 to generate a phage displa