荧光定量PCR法和ELISA检测儿童呼吸道感染病原体的意义.docVIP

荧光定量PCR法和检测儿童呼吸道感染病原体1976-），男，汉族，四川省邻水县人，硕士，主管技师，主要从事感染与免疫等方面的研究，已发表论文6篇，联系方式 （023-6361417；E-mail：laichengliu@126. com） 重庆医科大学儿童医院临床400014 重庆 ：肺炎支原体，肺炎衣原体，，诊断 R 【文献标识码】 A The evaluation of real time PCR and ELISA to detect children with respiratory tract infection pathogens Liu Laicheng, Zhang Penghui*. Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China 【Key words】Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, fluorescence quantitative PCR, ELISA, diagnosis Corresponding Author: Zhang Penghui, Tel: 86-23 E-mail: zhangph7203@ 儿童呼吸道感染是儿童秋冬季节常见的疾病，临床症状以发热、咳嗽、流涕等为主，近年来除了常见的细菌与病毒感染以外，肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）和肺炎衣原体（Chlamydiapliel pneumoniae，CP)）也逐渐成为急性呼吸道感染的主要病原体。由于该两类病原体的分离培养方法复杂，所需时间长，不便于临床快速诊断1]，而成为临床诊断棘手的问题。目前大多数医院对该两类病原体的检测仍以血清学方法如ELISA为主。但近年来随着分子生物学技术的发展，聚合酶链（PCR）反应，尤其是荧光定量PCR技术的广泛使用，为病原体的检测提供了新的技术与手段。本项目拟同时采用ELISA和荧光定量PCR技术对儿童呼吸道感染病原体进行检测，比较两种方法对病原体检出的阳性率、一致性和优越性。 1 材料和方法 1.1 患者资料 收集2009年01月-2010年12月在重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心就诊住院患儿3200例，其中男1750例，女1450例；年龄为1月～12岁。采用的标本为患儿深部痰液或肺部灌洗液进行分子检测，血清进行ELISA检测 1.2 试剂与仪器 肺炎支原体（MP）和肺炎衣原体（CP）荧光定量PCR检测试剂盒DNA提取购自中山大学达安基因公司；MP-IgM检测试剂盒（被动凝集法）Serodia- Myco II(Myco 11) 购自日本瑞必欧株式会社；CP-IgM检测试剂盒购自芬兰ANI Labsystems OY公司。荧光定量PCR分析仪采用澳大利亚Corbett 公司生产的6000型PCR仪和中山大学达安基因生产的DA7600型；酶标仪采用北京天石生产的SM-3型。 1.3 荧光定量PCR1.3.1 DNA提取：阳性与阴性质控品的处理：（1）向阴性质控品管中加入等量DNA提取液充分混匀，100℃煮沸10±1分钟；(2) 12,000rpm离心5分钟，备用。 1.3.2 标本处理：（1）痰液或灌洗液中加入4倍体积的4% NaOH，置常温下30分钟，使痰液充分液化；（2）用吸管混匀后吸取1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟；（3）去上清，重复上述步骤；（4）彻底去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃煮沸10分钟;（5）12,000rpm离心5分钟，备用。 1.3.3 荧光定量PCR扩增：严格按试剂盒说明书进行，（1）试剂准备：MP或CP反应液40μl + Tap酶3 μl人，分装至0.2ml PCR管中，备用。（2）加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（标本、阴性、阳性质控品）2μl，瞬时离心数秒，放入仪器样品槽。（3）PCR反应条件为93℃ 2 min， 93℃ 45s，55℃ 60s，10 cycles；93℃ 30s，55℃ 45s，30 cycles。 1.4 血清学检测取患儿静脉血2.0 ml，取血清作为待检样本，MP-IgM和CP-IgM检测的操作严格按各自的试剂盒说明书进行，结果以≥ 1:40判断为阳性。每次试验均设未致敏明胶颗粒、致敏明胶颗粒和阳性、阴性血清进行测定。 1.5 统计学方法 计量资料用均数±标准差（±s）表示，各年龄组与两种检测方法结果比较用Spearman 相关分析检验；各年龄组间确诊病例的阳性率比较用χ2检验。 2 结果 2.1 所收集到的3200例呼吸道感染患儿标本中，共检测出MP