细胞培养经验谈.doc

细胞培养经验谈 细胞生存所需营养和添加物 氨基酸 合成蛋白质。 糖 葡萄糖为主，提供能量代谢。 激素 很多激素具有促细胞生长作用 谷氨酰胺 促进氨基酸进入细胞膜，是核酸的成分。（注意：备用培基放置15天后需要补充谷氨酰胺） 抗菌素 青霉素100单位/ 毫升、链霉素100微克/毫升，制霉菌素25单位/毫升。 微量元素 生物刺激源 有些细胞须特殊刺激因子，例ECGF、NGF、TGF、FGF、HGF、EGF等。 生长基质成分 胶原、纤维连接蛋白、明胶、多聚赖氨酸。 细胞生长的密度依赖性 单个细胞不易生长，要加同种动物巨噬细胞补充密度，一般用腹腔巨噬细胞，105/ml。 血清： 1.促细胞生长因子，维生素, 激素及营养物质，其中的蛋白可解除脂肪酸、重金属离子、蛋白酶对细胞的毒性作用。 2.促进细胞贴壁。 3.小牛血清和胎牛血清应用最多，有的血清对细胞有毒性，要筛选。胎盘血清较成人血清好（胎盘血清含丰富的生长激素） 4.AB型血清无凝集素，可广泛使用自身血清在自身细胞培养时应用较好。 5.马血清、鸡血清在某些细胞培养时应用。 应用：须无菌，不溶血，分装保存-20℃，可用数年，但不能反复冻融。应用前灭活，56℃，30min。毒性和支原体检查，一般浓度5—20% 无菌操作 无菌室每周用过氧乙酸加紫外线消毒1一2次， 实验前，将实验器材放入超净台，同时启动风机紫外线照射30分钟后消毒完毕，使净化台内空气和台面构成无菌环境。 手指不能触及器材使用端，若碰到要更换。减少手与器材的接触面积， 一切操作都要在火焰周围进行，避免手从瓶口或其他器材上方经过，瓶口要经火焰消毒。 培养用液要专管专用，勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。 操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。 组织分离方法： 离心法：羊水，胸腹水、骨髓等，用细胞分离液进行密度梯度离心分离细胞。 组织切割法：无菌剥离脂肪及结缔组织，用含抗菌素的培养液洗涤去血液，用眼科剪剪成1mm3小块。 消化分离法： a 胰蛋白酶消化法: 用不含Ca++、Mg++的PBS配成0.1—0.25%的浓度，PH7.6，多用于贴附细胞传代。在做原代组织培养时可用胰酶松散组织，但不得超过30分钟。蛋白可吸附此酶，因此被消化的细胞要先洗去培养液。 b. 胶原酶消化法：主要用于纤维间质多的组织、软骨组织的消化，不受Ca++，Mg++影响，浓度0.1－0.3%，37℃1—24小时。 c. EDTA消化应不含Ca++、Mg++，EDTA可与Ca++、Mg++结合使细胞松散。浓度0.02％。 细胞消化传代 消化液 0.25％胰蛋白酶或0.1％胰酶含0.02%EDTA。 方法 1.悬浮细胞采用离心法传代或直接传代法。2.贴壁细胞传代用酶消化法：即平衡盐溶液洗涤细胞二次，加消化液，以刚好覆盖细胞为宜。放入370C培养箱片刻，不要震摇，在倒置显微镜下观察细胞消化变化，大部分细胞回缩变圆，间隙增大，用完全培基终止消化。用湾头吸管有序的吹下瓶壁细胞。将细胞悬液混匀使成单个细胞，分瓶加培养液继续培养。 细胞冻存与复苏 为了长期保存细胞、须冻存，可存数年。 冻存液： 培养液7份，血清2份，二甲基亚砜（DMSO）1份， 。 冻存方法： 冻存细胞的前一天换培养液，贴壁细胞经常规消化，洗涤，调整细胞浓度约106/ml, 用弹指法将细胞打散，逐滴加入冷的冻存液，迅速加入冻存管中，1.5ml/管。做好标记，-20℃2小时，-70℃过夜，入液氮冻存。 复苏方法: 备40℃水一杯，从液氮罐中取出所需细胞，迅速放入温水中解冻，待冰全部融化后，加入冷完全培养液中，离心洗涤两次，转入培养瓶培养。2-3天换液、传代。 ? 细胞运输 1.长距离运输 选择生长良好的单层细胞加培养液至瓶颈，保留微量空气，拧紧瓶盖，用胶带封好，包裹棉花，放在贴身口袋即可。到达目的地，吸出多于培养液（此液可继续使用），按常规培养。 2.短距离运输 （几小时）仅留少量培养液，防止细胞干燥，将细胞面朝上带回。 培养中细胞生长情况的识别 细胞生长 贴壁细胞增殖向周围扩张，互相融合连成片，可见细胞隆起饱满。 悬浮细胞呈圆形，具有折光性，大小不一，细胞壁光滑，透明无颗粒，细胞增殖旺盛时培养液易变酸。应及时更换培养液。 ?细胞死亡 表现：贴壁细胞开始回缩变圆或成细丝状，细胞间隙增大，胞壁增厚，胞内颗粒增加，粗糙，脱落，崩溃解体。悬浮细胞无光泽，胞内颗粒呈棕黑色，最后液化消失。 原因：污染，PH不适，谷氨酰胺过期，血清质量不佳，培养液过期和未及时换培养液，胶塞烧燃产生毒物，支原体污染，培养器皿不干净，水不纯等复杂原因。 商用细胞库 美国典型培养物保藏中心(Amer