629「629「细胞毒性测.PDFVIP

6/29「6/29 「細胞毒性細胞毒性測試測試」」 6/296/29 「「細胞毒性細胞毒性測測試試 」」 指導教授 ：謝秀梅 老師 撰寫人 ：台中高農 陳婷婷 老師 一、實驗目的 ： 利用不同酒精濃度的處理 ，以血液計算盤進行活細胞數目計算與生化反應（MTT 結晶染 色方式以細胞酵素活性對受質的作用 ），了解細胞存活率兩大種方法 ，探討酒精對細胞所具有 的毒性 。 MTT 分析法原理 ：利用存活細胞的粒線體酵素將MTT 試劑還原成 formazan 紫色結晶再 用 DMSO 將結晶溶解 ，而測得之溶解亦吸光質等於相對細胞存活率；因此存活細胞越多則顏 色越深 。 二、實驗材料 ： 1. 細胞株選擇 ：H549 人類肺腺癌細胞株。 a. 此為黏附型細胞由於增生能力快 ，可快速大量增生，因此適合當作實驗樣品的供應。 b. 由於黏附力強 ，不需要在培養盤底部進行處理亦可黏附很好，也對胰蛋白酶比較具有 耐性 ，因此處理時間可以稍久。 2. 細胞數目計算 ： a. 6 公分細胞培養盤三盤 （分成0%對照 、1.5%、3%三種不同濃度酒精處理） b. PBS 溶液沖洗 、Trypsin-EDTA 溶液、培養液、trypan blue 染劑、小試管×3 c. 37℃細胞培養箱 、無菌操作台、pipet d. 血球計算盤組 、計數器、光學顯微鏡 3. MTT 分析法 ： a. 12 孔細胞培養盤 （分成0%對照 、1.5%、3%三種不同濃度酒精處理；每組四重複 ） b. MTT、DMSO、pipet c. 利用 ELISA reader 進行 OD 吸光值測定顏色變化以了解細胞活性 三、實驗步驟 ： 1. 細胞數目計算 ： a. 將培養盤中的培養液吸掉 b. 用 1.5ml 1×PBS 洗掉培養液中抑制胰蛋白酶的物質 c. 加入 1× Trpsin-EDTA 1.5ml 至培養皿中放入 37℃培養 7 分鐘 （腫瘤細胞黏附力強，較 耐 Trpsin 作用 ；所以可以用較高量的Trpsin 處理較長的時間 ） d. 輕拍培養盤將細胞震下 ；加入Trpsin-EDTA 兩倍量 （3ml）的培養液混合均勻 ，以抑 制 Trpsin 的反應 e. 將盤中細胞充分沖洗與混合後 ，將盤中液體全部吸出至 15cc 離心管中 f. 利用 1200 rpm 離心 5 分鐘 ，吸除上清液後再加入 1ml 培養液混合均勻 g. 取 50 μl 細胞液至離心管中並混合均勻 ，取 10 μl 細胞液與 10 μl Trypan blue 混勻 h. 取適當稀釋液分別由兩端注入細胞計數盤中 ，在光學顯微鏡下以血球計算盤計算四個 1 白血球區塊的細胞總合 i. 將所得數值帶入公式進行計算與不同酒精濃度之細胞數目比較 j. 注意事項 ： 3 -4 ㄅ 、血球計算盤為計算四周的四大格 白血球計算區 ，每大格體積為 0.1 mm ＝10 ml (1mmL×1mmW×0.1mmH) ㄆ 、計算盤使用過後需用清水沖洗後已酒精進行乾燥 ；必要可用拭鏡紙壓擦使乾燥 ㄇ 、計算細胞總數 N （兩個 chamber，每個 chamber 有四區 ，因此為共八區的細胞總合 ） ㄈ 、計算公式為： (N/8)【每一大格細胞數】×2 【稀釋倍數 】×104 【體積換算 】(cell/ml) ㄉ 、當每格細胞總數差異過大 （大於平均值 20%）則因細胞分佈