PCR快速鉴定猪链球菌2型.PDFVIP

维普资讯 2007，23 (11) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ChineseJournalofZoonoses 1083 文章编号：1002—2694(2007)11—1083—05 应用多重荧光Real—timePCR快速鉴定猪链球菌2型* 王君玮 ，王志亮 ，王伟伟 ，赵永刚 ，孙承英 ，李 林 ，赵云玲 ，张 维 摘 要 ：目的 建立能同时鉴定链球菌 2型(s．suis2)和确定主要毒力标志 MRP的快速检测方法。方法 根据 S．suis2 CPS2J与 MRP的保守序列，设计并合成 了2对 引物及其相应探针。通过优化各反应物 的浓度 、配 比和循环程序 ，建立 能从组 织 中直接检测 CPS2J和 MRP的实时荧光PCR方法 。结果 能在3h内对送检组织样 品检测确定 S．suls2型和 MRP毒力基 因，最低检测菌体浓度 24CFU／ml。与普通 PCR相 比，敏感性在检测 CPS2J时比普通 PCR高至少 lO倍 以上，而在检测 MRP 时比其高100倍。与葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、S．suis1型、9型等无交叉反应。同一人在试剂放置 0d、20d和 60d检 测 ，以及不同人用同一方法检测，变异系数均小于5％，差异不显著 。用于检测 SSsc0501攻毒后的样 品，结果在心、肝、脾、肺、 肾、淋巴结、脑中均检测到S．suis2阳性，MRP阳性。而在肌肉中，S．suis2和MRP均为阴性。结论 建立的多重荧光Real— timePCR敏感性高、特异性强，稳定性和重复性好，能用于可疑 S．suis2型组织样品的快速定型和毒力鉴定。 关键词 ：猪链球菌2型；多重荧光 I’CR；MRP；CPS2J 中图分类号 ：S852．6 文献标识码 ：A Rapididentificationofstreptococcussuistype2withM ultiReal—timePCR W ANGJun-wei，WANG Zhi—liang，WANGWei—wei，ZHAO Yong—gang， SUN Cheng—ying，LIlin，ZHAO Yun-ling ，ZHANG W ei (ChinaAnimalHealthandEpideHti0l0g，，Qingdao266114，China) ABSTRACT：TwosetsofprimersandthecorrespondingfluorescentprobesweresynthesizedaccordingtotheCps2jand MrpconservedgenesequencesofStreptococcussuistype2(S．suis2)toestablishtheidentificationofS．suis2andthemainvir— ulencemarkerMrp．Themultireal-timePCRwhichcoulddetecttilepresenceofcps2jandmrpgenesdirectlyfromtissues，was setupafteroptimizationofreactionconcentration，matchingandcycleprogramme．Theexperimentalresultsrevealedthatthis kindofmultireal—timePCR could detectS．suis2andthemrp gcneinsampleswithin3hoursandataconcentrationof24 CFU／m1．ComparedtothetraditionalPCR，itssensitivitytodetectcps2jgenewasatleast10timesandthattodetectmrpgene was100timeshigherthanthatofthetraditionalPCR．Therewasno crossreactionwith Staphylococci，Streptococcu