益气活血方对缺血缺氧刺激下心肌细胞蛋白激酶C活性影响.docVIP

益气活血方对缺血缺氧刺激下心肌细胞蛋白激酶C活性影响【摘要】目的：探讨益气活血方(YQHXF)治疗缺血缺氧性心血管疾病的机理。方法：用自制的密闭有机玻璃盒填充造成大鼠乳鼠心肌细胞缺氧环境，用低糖培养基造成缺血的环境，从而制成心肌细胞的缺血缺氧模型。然后用γ-闪烁计数仪测定蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）的活性。结果：缺血缺氧状态下心肌细胞胞浆PKC的活性上升（vs正常组P0.05)。结论：益气活血方对缺血缺氧性心脑血管疾病的治疗作用可能与调节心肌细胞的PKC活性有关。 【关键词】益气活血方；心肌细胞；蛋白激酶C；缺血缺氧 文章编号：1009-5519（2007）18-2689-02 中图分类号：R26 文献标识码：A 益气活血方是中药黄芪、川芎、黄精、赤芍、红花、三七等药物组成的中药复方，在防治缺血性心脑血管疾病有较好的疗效。它能够降低血中脂质过氧化物形成，改善缺血后血流灌注，降低血液黏滞度，调节环磷酸鸟苷（cGMP）和环磷酸腺苷（cAMP）的动态平衡，促进血管新生[1，2]。但益气活血方如何在细胞水平上发挥其作用尚不清楚。近来的研究表明PKC在心血管的舒缩功能有重要的作用，本实验旨在通过体外培养的大鼠心肌细胞缺氧缺血模型，观察益气活血方对心肌细胞缺血缺氧条件下PKC活性的影响，以探讨益气活血方治疗缺血性心脑血管疾病的机制。 1 材料与方法 1.1 大鼠心肌细胞的培养：出生2~4日龄的大鼠幼鼠，75%酒精消毒皮肤。无菌操作取出心脏，用D-Hanks液或无血清培养基洗去血液。去外膜后用眼科剪将其剪碎。然后加入0.06%胰蛋白酶, 35~37℃消化10分钟，弃上清液。再加0.06%胰蛋白酶消化2~3次，每次10分钟。收集每次消化后的上清液，加血清终止消化。最后1 000 r/min，离心5分钟，细胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM培养基悬浮， 以5×105/ml接种到培养瓶中。 置5%CO2 37℃ 细胞培养箱中培养1～ 2小时后再轻轻吸出细胞上清, 接种到新的培养瓶中继续培养。隔天换液，待细胞快融合时进行实验[3,4]。 1.2 益气活血方含药血清的制备：将益气活血方复方制成水煎液，浓缩成每ml含1.25 g生药，4℃保存于冰箱中。取清洁级SD成年大鼠，体重180~220 g，雌雄不拘，随机分成两组，一组为灌服益气活血方组，一组为灌服生理盐水对照组。益气活血方的灌服剂量按成人与大鼠的体表面积换算成大鼠的用药剂量，每日灌服2次，每次2 ml，连续灌服7天，末次灌服1小时后经腹主动脉无菌取血，离心后得大鼠含药血清，过滤除菌后-20℃保存。生理盐水对照组的灌服和取血方法同益气活血方灌服组[5]。 1.3 心肌细胞缺血缺氧模型的复制：用自制的有机玻璃小盒，充入95%N2＋5%CO2，同时在培养瓶中加入低糖的培养基，作用4小时制成缺血缺氧模型[6]。 1.4 PKC的提取和测量：取原代心肌细胞，在冰上收集细胞，然后用低渗缓冲液孵育15分钟，超声粉碎仪粉碎细胞。4 ℃下18 000 r/min，1小时，上清液为细胞浆PKC的提取物。沉淀加入0.5% Triton X-100的缓冲液，同样在冰冻状态下孵育30分钟，4℃,10 000 r/m，10分钟，所得上清液为胞膜PKC的提取物，将所得的提取物通过层析柱DE-52过滤，然后收集通过紫外分析仪波峰时的洗脱液，即为比较纯的PKC提取物。 将提取的PKC加入到含有组蛋白、磷脂酰丝胺酸和γ-32P ATP的缓冲液中，置于30℃温浴30分钟，然后用γ-闪烁计数仪检测放射性，通过放射性计算PKC的活性。PKC的活性单位以fmol/mgmin-1计算。 1.5 实验分组：实验分为正常组（不做任何处理8小时后收集细胞测定PKC活性），治疗组（缺血缺氧4小时后加含药血清作用4小时再收集细胞，含药血清终浓度为20%），对照组（缺血缺氧4小时后加等量的生理盐水灌服组的大鼠血清，血清终浓度同治疗组，4小时后再收集细胞），每组重复3次。 1.6 统计方法：应用SPSS10.0电脑统计软件，数据用平均数±标准差（x±s）表示，用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P0.05，差异无显著性。胞膜PKC假治疗组与正常组相比，P0.05，差异无显著性。 3 讨论 PKC是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起着重要作用。PKC通过催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化，调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。 PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞， 静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以Ca2+依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上， 此过程称之为转位。一般将PKC的转位作为PKC激活