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胚胎干细胞体外诱导分化探究进展[关键词]胚胎干细胞；体外诱导分化 [中图分类号] R318 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）06（c）-008-02 自1981年英国的Evans等[1]和美国的Martin[2]相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来，胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前，已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法，将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。 1 ＥＳ细胞的特性 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ＥＳ细胞)是从早期胚胎（桑椹胚、囊胚）或原始生殖细胞(primordial germ cell，PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。目前有关ＥＳ细胞特征的研究主要来源于小鼠的实验。 小鼠ＥＳ细胞系的特征包括：①能大量繁殖并保持未分化状态；②在一定条件下具有向三个胚层组织和细胞分化的全能性；③能够形成嵌合体动物，即ＥＳ，细胞具有种系传递功能；④易于进行基因改造操作。 2 ＥＳ细胞体外诱导分化的细胞类型或结构 新近大部分胚胎干细胞诱导类型分化的实验都集中在小鼠实验中，小鼠胚胎干细胞在体外分化的细胞类型或结构主要有下列几种： 2.1 造血细胞 Wiles提出了ES细胞体外分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等一系列造血系统的细胞的报道[3]。这表明在合适的培养条件下，ＥＳ细胞是可以分化为造血细胞，但是这种条件中需有胎牛血清，在此血清中含有一些因子，对ＥＳ细胞向造血细胞分化起着重要作用。如果没有胎牛血清，ＥＳ细胞向造血细胞分化的效率极低。有学者发现ES细胞用β-巯基乙醇(β-ME)等药物处理，可发育成拟胚体(EB)。然后，用胰蛋白酶消化成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和胚胎细胞条件培养液处理，可使其定向分化为造血干细胞[4]。这一重要进展不仅为分析研究ES细胞分化，为造血干细胞的早期决定及分化机制和过程提供了实验模型，而且也为临床上移植或输血应用的血液找到了一个新的突破口。 2.2 血管和内皮细胞 丛笑倩等[5]将小鼠ES细胞单层培养在含重组转化生长因子β1(TGF-β1)的Ⅰ型胶原蛋白为基质的三维系统内，或直接将过度表达TGF-β1的ES细胞单层培养在Ⅰ型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的血管样结构。此外用重组TGF-β1处理的ES细胞中，能检测到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达。这些结果提示TGF-β1可能调节ES细胞和(或)其分化细胞的bFGF基因表达,bFGF可能作为血管内皮细胞的生长因子之一促进内皮细胞分化和形成血管。随后Balconi等[6]在Vinel研究的基础上通过免疫磁珠分离的方法将分化出的内皮细胞纯化出来。由此可以看出ＥＳ细胞体外分化系统是研究内皮细胞与血管发生的细胞和分子机制的较理想模型。 2.3 心肌细胞和肌肉细胞 悬浮或悬滴培养的小鼠ＥＳ细胞的拟胚体(ＥＢ)在维甲酸(ＲＡ)诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些具节律性自发收缩活力的分化细胞集落。电镜观察证实，收缩的细胞内存在着肌原纤维和肌小节和闰盘等典型的心肌细胞特有结构。如将小鼠ＥＳ拟胚体与畸胎瘤细胞(EC)衍生的内胚层样END-2细胞联合培养，也可观察到ＥＳ细胞被诱导分化为有节律搏动的心肌细胞和骨骼肌细胞现象。为探究心肌细胞是怎样形成的,近年来人们进行了不少研究，研究的主要目的就是要弄清：①心肌细胞是怎样由它的前身细胞分化而来；②心肌基因表达及不同离子通道的功能表达之间的关系；③形态和离子通道调控变化的关系。与已分化细胞相比，人们对心肌前体细胞的功能特征的认识知之甚少，原因是此时鼠胚体积小，其前体又缺乏横纹和自发性收缩的特性，很难鉴定。现在用ＥＳ细胞研究可很好地解决这些问题。Kolossov等[7]研究发现：电位依赖性Ｌ型Ca2+离子通道(VDCC)是心肌细胞早期发育的标志，而三磷酸肌醇受体(IP3R)肌浆网Ca-ATPase早在心肌细胞形成前就已表达。关于心肌细胞形成过程中不同阶段ＥＳ细胞的作用，有望应用选择性药理。 2.4 神经细胞 单层培养ＥＳ细胞在10 μmol/Ｌ维甲酸与1 mmol/L双丁酰基环腺苷磷酸(db-cAMP)的共同作用下，90%～95%的分化细胞为神经胶质细胞。ＥＳ细胞、ＥＢ在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元，但效率不高。而用悬浮培养4 d的ＥＢ在含ＲＡ的培养液中继续培养4 d，