木聚糖酶与CMC活力测定方法.doc

木聚糖酶活力的测定方法 1. 方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。 原理： 还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。 3. 主要仪器和设备 天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。 4. 试剂和溶液 4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。 4.2 DNS试剂 称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。 4.3 0.1mol/L，pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液 吸取冰醋酸1.8ml,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解, 定容至1000ml,调节PH至5.00±0.01后使用。室温下存放2个月有效。 4.4 0.1%即1mg/ml木糖标准溶液 无水木糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。 4.5 1.0%木聚糖溶液 称取木聚糖1.00g于烧杯中，用2ml 0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40ml缓冲液，于60～70℃水浴中加热溶解，冷凉后用0.5mol/L醋酸（约2ml）调pH5.0，转入容量瓶中,加缓冲液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置时间长了出现沉淀，使用前应在热水浴中热溶。 4.6 木糖标准曲线的绘制 吸取1mg/ml木糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。以吸光度为纵坐标，木糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与木糖量的关系。 5. 待测酶样品的处理 5.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。 5.2 液体曲：离心上清液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。 5.3 固体曲：按干重计称取4g于三角瓶中，加水200ml，室温下磁力搅拌浸提0.5h。取离心上清液做适当稀释。 5.4 固体粉状酶：称取适量于烧杯中(精确至0.0001g)，用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。 5.5 固体粒状酶：研磨成粉后如5.3处理。 6. 酶活力测定 取15 ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀) (4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致, 50℃水解10 min. 反应步骤及试剂、溶液用量见下表: 试样 空白 1.加底物(4.5)1.8ml 1.加底物(4.5)1.8ml 2.50℃ 2.50℃ 3.加酶液0.2ml 3. 50℃ 4.混合 4. 加DNS试剂3 ml 5.50℃ 5. 混合 6.加DNS试剂3 ml 6. 加酶液0.2 ml 7.混合 7.混合 8.沸水浴中10 min 8.沸水浴中10 min 9.冷却定容至15 ml 9.冷却定容至15 ml 10.空白调零540nm下测定 10.空白调零540nm下测定 酶活力单位计算 酶活力＝(S×D×1000)/（0.2×10）×1.7 μg/ml(g).min 式中： S—测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量，mg数； D—酶液或酶粉稀释倍数； 1000— mg和μg之间的换算系数； 0.2—测定所取酶液量，ml数； 10—反应时间，min数； 1.7—方法换算系数。 酶活力单位定义及换算 8.1 本方法酶活定义:在本测定条件下，每分钟水解木聚糖产生1μg还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。 国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解木聚糖产生1μmol还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。 8.2 u与国际单位IU 的换算关系： 1 u＝1÷150 IU（μmol糖/ml(g).min） 150: 木糖的分子量 内切纤维素酶(CMC酶)活力的测定方法 1. 方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。 2. 原理： 还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3，5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。 3. 主要仪器和设备 天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。 4.