DNA提取操作.docVIP

基因组DNA提取 基因组DNA提取试剂盒简介 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。 一、基因组DNA提取的原则 1、保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。 2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。 二、基因组DNA提取的原理和方法 DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。 1、样品预处理 从各种不同来源的样品(如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等)中提取高纯度的基因组DNA，因细胞结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了解，请参考本公司各基因组DNA提取试剂盒说明书。 部分样品预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物材料匀浆、液氮研磨 培养细胞蛋白酶K处理 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨 血液红细胞裂解液去红细胞 2、细胞裂解 CTAB法： 适用于植物组织、真菌等。 CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7M NaCl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 SDS法： 适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。 SDS是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析。 其它裂解方法： 物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等 酶法：蛋白酶K 3、DNA分离纯化 纯化要求： 核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。 其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到最低程度。 排除其它核酸分子的污染，如提DNA时应去除RNA，反之亦然。 纯化方法： 细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单，因此硅基质材料成为大规模分离纯化DNA的通用方法。 硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。 注意事项： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。 防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子螯和剂螯和Mg2+以抑制DNase的活性。 减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase大量释放，样品反复冻融和高温等。 4、DNA洗脱收集 DNA的洗脱效率取决于以下重要因素： 洗脱液成分： 采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是TE(pH8.0)，既为DNA从硅基质膜上洗脱下来提供良好的pH环境，其中的EDTA又能保证DNA不被DNase降解，同时由于EDTA浓度非常低，对核酸内切酶、DNA聚合酶的影响非常微弱，不影响后续试验，可放心使用。 洗脱液体积： 当洗脱液体积小于30ul时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在50-200ul时，洗脱效率稳定在80-90﹪，并可保证得到最大产量，因此洗脱液体积不能小于30ul。 加洗脱液部位： 100-200ul洗脱液能完全覆盖硅基质膜，DNA的洗脱量可得到保证，但当洗脱液体积较少如30-50ul时，须在硅基质膜中间部分悬空滴加洗脱液，以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。 洗脱液的温度：