CD - 科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞 .ppt

圆二色谱Circular Dichroism (CD) Application 圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子的二级结构。 可应用于：蛋白质折叠﹑蛋白质构象研究, DNA/RNA反应, 酶动力学, 光学活性物质纯度测量, 药物定量分析。天然有机化学与立体有机化学, 物理化学, 生物化学与宏观大分子, 金属络合物, 聚合物化学等相关的科学研究。 构 象 确定蛋白质构象最准确的方法是x-射线晶体衍射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。 圆二色光谱：研究稀溶液中蛋白质构象，快速、简单、较准确 主要内容 CD原理 蛋白质CD谱 CD实验要点 CD原理 圆二色性(circular dichroism, CD) 当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时，由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同的两种构型，故它们对平面偏振光所分解成的右旋和左旋圆偏振光吸收不同，从而产生圆二色性． 圆二色性的表示  椭圆度?，摩尔椭圆度[?]  ?=2.303(AL – AR)/4 [?] = 3298(?L - ?R)?3300 (?L - ?R) 在蛋白质研究中， 常用平均残基摩尔椭圆度 圆二色仪原理 蛋白质的CD谱 蛋白质的光学活性 蛋白质的CD谱 CD spectra in the far UV region (180 nm – 250 nm) probes the secondary structures of proteins. CD spectra in the near UV region (~250 and ~ 350) monitors the side chain tertiary structures of proteins. Near UV CD spectrum 蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320 nm，表现出CD信号。 Phe残基: 255、261和268 nm附近；Tyr残基:277 nm左右；而在279、284和291 nm是Trp残基的信息；二硫键的变化信息反映在整个近紫外CD谱上。 近紫外CD谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能用来研究蛋白质三级结构精细变化。 Near UV CD spectrum of Lysozyme Far UV CD spectra of poly-L-Lys 估算蛋白质?螺旋含量 Limitations of CD secondary structure analysis The simple deconvolution of a CD spectrum into 4 or 5 components which do not vary from one protein to another is a gross over-simplification. The reference CD spectra corresponding to 100% helix, sheet, turn etc are not directly applicable to proteins which contain short sections of the various structures e.g. The CD of an α-helix is known to increase with increasing helix length, CD of β-sheets are very sensitive to environment geometry. Far UV curves (275nm) can contain contributions from aromatic amino-acids, in practice CD is measured at wavelengths below this. The shapes of far UV CD curves depend on tertiary as well as secondary structure. 蛋白的三级结构 1976年，Levitt和Chothia曾在Nature上报道，规则蛋白质的三级结构模型可分为4类 (1) 全α型，以仅α-螺旋结构为主，其分量大于40％ ，而β-折叠的分量小于5％