株猪瘟病毒田间株E0蛋白基因.PDF

维普资讯 中周动物检疫 2007年第 24卷第 1期 一 22一 文章编号：1005—944X(2007)01-0022—03 一 株猪瘟病毒田间株E0蛋白基因 的克隆和序列分析的研究 龚振华 王钰璇 刘 坤 李维彬 祝 丽 ，)王玉东 李玉清 刘国庆21郑增忍 蒋正军 (中国动物卫生与流行病学中心 青岛 266032) 摘要：采用RT—PCR技术，扩增猪瘟病毒田问株XN株的E0蛋 白基因，构建E0基因的重组质粒，序列分 析表明，该病毒EO蛋白DNA序列与国内几株流行株的同源性高达99％。与CSFV一1、CSFV一2群猪瘟病毒的 差异较大，该病毒EO蛋白191~227段DNA和氨基酸序列与国内流行株比较同源性相对较高．而与不同基因 群CSFV国外流行株比较时同源性相对较低。 关键词：猪瘟病毒，序列分析，重组质粒 E0蛋白是猪瘟病毒 (CSFV)的 载体，用于克隆PCR产物。． [句． 将E0蛋 白基因的PCR产物纯化 一 种结构蛋白。由227个氨基酸组 1．3 引物 参考猪瘟病毒A1f_0n／回收．加入pUCm—T载体 、连接缓 成，分子量约44～48Kda。EO蛋 白对 187株序列设计引物 CSFvFl141 冲液和 T4DNA连接 酶 。构建 于猪瘟病毒具有结构和RNA酶双 和 CSFVRl888．CSFVF1141和 CS． pUCm—CSFEO重组质粒 重功能，在病毒感染细胞和病毒复 FVR1888位于EO蛋 白基因两端。 2．4 序列分析 采用 Sanger’s双 制过程中起调控作用[11。E0蛋 白与 CSFVF1141：5一aatagc aat tat 脱氧链终止法进行双向反应．测定 病毒对宿主细胞的嗜性以及病毒的 gta cca ac-3；CSFVR1888：5一 cta pUCm—CSFEO重组质粒插入 EO蛋 致病力关系密切．可导致机体免疫 ttttacttgttacattacagt——3 白DNA序列．测序引物为载体上位 抑制．引起动物淋巴细胞和上皮细 2 方法 于插入 E0蛋 白DNA两端的引物 胞凋亡2[1不同基因群 CSFv的EO 2．1 CSFV RNA反转录反应 采 M13／pUC(一20)和M13／pUCf一26)。 蛋白DNA序列有较大差异．目前已 用 Trizol提取病毒 RNA．在有核酸 3 结果 知E0蛋 白有 3个重叠的抗原表位 的1．5mlEP管中依次加入5×反转 3．1 RT—PCR 用引物 CSFVF1141 区．能在病毒感染动物后诱导机体 录 buffer4．0 ，2．5mM dNTP3．0 和 CSFVR1888对 CSFv的RNA进 产生较强的抗体反应3[1。EO蛋白的 L，10pmol／~L引物 CSFVF1141和 行 RT—PCR反应．如图1所示，猪 191227氨基酸具有猪瘟病毒特异 CSFVR1888 各 O．75 L，40U／i~L 淋巴结样品在 740bp的位置扩增 性．可将 CSFv与BVDV和BDV区 RNA酶抑制剂 1 L，10U／i~LMM． 出了一条特异的cDNA．即为猪瘟 分．是诊断猪瘟抗体的理想抗原4[1。 LV反转录酶 1 L，无菌双蒸水9．5 病毒XN株EO蛋白基因图1 1 2 在国外 ．已经建立了E0蛋白作为 L，共计 20 L。37℃反应 1h。 抗原的快速诊断技术同。我们对一 2．2 PCR反应 在 O．5IrIlEP管中 株来 自猪组织病料的猪瘟野毒株 依次加入 10xPCRBuffer3．0 L。25 2000bp lO00b~, XN株的EO蛋白全基因